胡衛(wèi)平,焦嫚,董學(xué)芝,王鑫
(河南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院環(huán)境與分析科學(xué)研究所,河南 開封 475004)
蛋白質(zhì)是人類生命活動中最重要的物質(zhì)基礎(chǔ),基本組成單位是氨基酸,組成蛋白質(zhì)的氨基酸有20余種,體內(nèi)只能合成一部分,其余則由食物蛋白質(zhì)供給,準(zhǔn)確測定蛋白質(zhì)的含量是評價一種食品質(zhì)量的重要手段[1]。目前蛋白質(zhì)含量的測定方法很多,蛋白質(zhì)的測定方法主要有紫外吸收法[2]、共振瑞利散射法[3]、電感耦合等離子體法[4]、流動注射法[5]等。
紫外分光光度法由于操作簡單、儀器使用方便、測定速度快等優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用廣泛,目前分光光度法測定蛋白質(zhì)的研究主要是利用小分子有機(jī)染料與蛋白質(zhì)相結(jié)合的光譜探針方面。結(jié)晶紫是一種堿性三苯甲烷類染料,已有文獻(xiàn)報道,以結(jié)晶紫為顯色劑,與牛血清白蛋白(BSA)作用生成紫紅色配合物,并且吸光度較結(jié)晶紫明顯增大,從而測定蛋白質(zhì)的含量[6]。
但是利用結(jié)晶紫與ZnS相結(jié)合并用分光光度法測定蛋白質(zhì)的含量鮮見報道?;赯nS與結(jié)晶紫作用可使結(jié)晶紫的吸光度降低,加入不同量的蛋白質(zhì),體系的吸光度逐漸增大,并且與BSA濃度在一定范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。據(jù)此,建立了結(jié)晶紫-ZnS-BSA分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的新方法。
牛血清白蛋白(BSA):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;B-R緩沖溶液(取濃度均為0.04 mol/L的硼酸、磷酸、醋酸混合溶液,用0.02 mol/L的NaOH調(diào)至所需pH);NaH2PO4(0.0175 mol/L)-Na2HPO4(0.0175 mol/L)緩沖溶液(pH=7.00);巰基乙酸(0.1 mol/L),Zn(Ac)2·2H2O(0.1 mol/L),Na2S(0.1 mol/L),結(jié)晶紫(10-4mol/L),濃氨水。所用試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。
Labtech-1000紫外-可見分光光度計:北京萊伯泰科儀器有限公司;pHS-3CT型酸度計:上海大普儀器有限公司;CL-4型恒溫加熱磁力攪拌器:鄭州長城科工貿(mào)有限公司。
在80mL的燒杯中,依次加入蒸餾水50mL、Zn(Ac)2·2H2O 5 mL、巰基乙酸5 mL,加熱到70℃,用濃氨水溶液調(diào)節(jié)pH到8.35。在磁力攪拌器作用下,緩慢加入Na2S 4 mL,攪拌2 h,得到一定粒徑大小的ZnS納米微粒。
在10 mL容量瓶中,依次加入0.5 mL結(jié)晶紫溶液、3.5 mL NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液、2 mL ZnS 溶液、含適量BSA的溶液,蒸餾水稀釋至刻度,搖勻。于30℃溫度下反應(yīng) 15 min,在最大吸收波長(λmax)590 nm處進(jìn)行測定。
體系的吸收光譜示于圖1。
圖1 紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption spectrum
可以看出BSA與ZnS在可見光區(qū)無吸收,結(jié)晶紫在590 nm處有最大吸收,加入ZnS溶液反應(yīng)后使結(jié)晶紫吸光度降低,隨著不同量BSA溶液的加入,體系的吸光度逐漸增大。
配制一系列不同pH的B-R緩沖溶液,按照試驗(yàn)方法,測定不同酸度下的吸光度A,以A對不同酸度(pH)作圖(見圖2)。
圖2 酸度的影響Fig.2 Effect of Acidity
試驗(yàn)表明,隨著pH的增大,A逐漸降低,但當(dāng)體系的酸度(pH)在6.0~8.0范圍內(nèi),體系A(chǔ)趨于穩(wěn)定,試驗(yàn)選擇pH為7.0的緩沖溶液。
試驗(yàn)對 Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4、Na2HPO4-檸檬酸、檸檬酸-檸檬酸鈉、NaH2PO4-NaOH及B-R緩沖溶液進(jìn)行選擇,表明pH為7.0的Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4緩沖溶液使體系的吸光度增加顯著。
進(jìn)一步對緩沖溶液的用量進(jìn)行選擇,見圖3。
圖3 緩沖溶液用量的影響Fig.3 Effect of the volume of buffer
試驗(yàn)表明,隨著緩沖溶液用量的增加,A逐漸增大,在3.5 mL時體系吸光度達(dá)到最大。試驗(yàn)選擇pH7.0的 Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4緩沖溶液 3.5 mL。
按照試驗(yàn)方法,固定其他條件不變,取不同體積的結(jié)晶紫溶液(10-4mol/L),并測定體系的吸光度,見圖4。
圖4 結(jié)晶紫溶液用量的影響Fig.4 Effect of the volume of methyl violet
試驗(yàn)表明,隨著結(jié)晶紫用量的增加,吸光度逐漸增大,在0.5 mL后吸光度增加緩慢,因此選擇10-4mol/L的結(jié)晶紫溶液0.5 mL。
固定其他條件不變,改變ZnS的用量,測定體系的吸光度,以吸光度A對ZnS的用量作圖,見圖5。
試驗(yàn)表明,隨著ZnS用量的增多,體系的吸光度逐漸降低,當(dāng)用量達(dá)到2.0 mL~3.0 mL時,體系吸光度趨于穩(wěn)定。選擇ZnS溶液用量為2.0 mL。
圖5 ZnS用量的影響Fig.5 Effect of the volume of ZnS
用溫度控制儀調(diào)節(jié)水溫,在20℃~70℃溫度范圍內(nèi)分別測定溫度對體系吸光度的影響,結(jié)果表明,20℃~40℃體系較為穩(wěn)定,隨著溫度的升高,體系的吸光度逐漸升高,試驗(yàn)選擇溫度為30℃。
在30℃的溫度下,測定反應(yīng)時間對體系的影響,見圖6。
圖6 時間的影響Fig.6 Effect of the reaction time
試驗(yàn)表明,隨反應(yīng)時間的增加,體系的吸光度逐漸升高,而反應(yīng)20 min后,吸光度增加緩慢,因此選定反應(yīng)時間為20 min。
按照試驗(yàn)方法,加入不同量的BSA,測定體系的吸光度,以吸光度A對BSA濃度C作圖,見7所示。
試驗(yàn)表明,A與BSA濃度在0.0100mg/mL~4.400mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為A=2.0406+0.46050 C(mg/mL),相關(guān)系數(shù)R=0.9962,檢出限為0.009152 mg/mL。
考察了常見的金屬離子及多種氨基酸對含有5μg/mL BSA體系的影響,結(jié)果表明,在±5%誤差允許范圍內(nèi),100倍的檸檬酸三鈉、淀粉、甘氨酸、蔗糖、葡萄糖、尿素、安賽蜜、三聚氰胺,50倍的L-谷氨酸,DL-蘋果酸、NaCl、NH4Cl、KCl,25 倍的 FeCl3、FeSO4、AlCl3,同倍的 BaCl2、Mg(NO3)2、Pb(NO3)2對試驗(yàn)均沒有影響。
圖7 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 The calibration curve
取肉松 6.5160 g、牛奶 1.9949 g、雞精 5.0050 g,分別稀釋定容至100 mL,振蕩5 h,使樣品中蛋白質(zhì)充分溶解。再取少量乙醚萃取3次除去樣品中的脂肪,棄去溶有脂肪的乙醚層,過濾,濾液即為待測液。按照試驗(yàn)方法,測定樣品中BSA的含量,且與考馬斯亮藍(lán)法做對照,結(jié)果見表1。
吸取一定量的樣品測試液,分別加入一定量的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照實(shí)驗(yàn)方法做加標(biāo)回收試驗(yàn),結(jié)果見表2,可以看出樣品平均回收率較好,說明該方法較準(zhǔn)確。
表1 樣品中BSA的測定結(jié)果Table1 Determination results of BSA samples
表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)Table 2 Recovery test
利用ZnS與結(jié)晶紫作用,生成復(fù)合物,該復(fù)合物與蛋白質(zhì)作用,使體系吸光度顯著增大,采用分光光度法法測定樣品中蛋白質(zhì)的含量。該方法準(zhǔn)確、簡單、快速、線性范圍寬,通過測定樣品并與標(biāo)準(zhǔn)方法做對照,結(jié)果滿意,可用于食品中蛋白質(zhì)含量的測定。
[1]張紅英,王麗,郭愛靜.應(yīng)用Primacs SN總氮/蛋白質(zhì)分析儀測定食品中的蛋白質(zhì)[J].理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊,2007,43(12):976-978
[2]楊睿,劉紹璞.某些分子光譜法測定蛋白質(zhì)的進(jìn)展[J].分析化學(xué),2001,29(2):232-241
[3]Long X F,Liu S P,Kong L,et al.A study on the interaction of proteins with some heteropoly compounds and their analytical application by resonance Rayleigh scattering method[J].Talanta,2004,3(63):279-286
[4]Lamer-Déchamps S L,Poucheret P,Pérez J L.Validation of an inductively coupled plasma-mass spectrometry method to quantify tungsten in human plasma.Determination of percentage binding to plasma proteins[J].Clinica chimica acta,2003,327(23):39-46
[5]Ying Li,Lijun Dong,Weiping Wang.Flow injection analysis-Rayleigh light scattering detection for online determination of protein in human serum sample[J].Analytical biochemistry,2006,354(4):64-69
[6]杜鵑.結(jié)晶紫分光光度法測定蛋白質(zhì)的含量[J].化學(xué)分析計量,2006,15(4):46-47