朱曉璐，林昀，李霞（1.重慶大學生物工程學院，重慶400044；.重慶市藥品檢驗所，重慶40111）

妥布霉素屬氨基糖苷類抗菌藥物，在紫外波段上只有末端吸收，2005年版《中國藥典》[1]未對硫酸妥布霉素注射液中的有關(guān)物質(zhì)進行控制；《美國藥典（USP）》31版[2]上采用薄層色譜（TLC）方法進行有關(guān)物質(zhì)控制，該方法經(jīng)筆者進行一系列方法學驗證，發(fā)現(xiàn)不能有效控制妥布霉素中的有關(guān)物質(zhì)，而《英國藥典（BP）》2008版[3]、《歐洲藥典》6.0版[4]上均采用的電化學檢測-高效液相色譜（HPLC）法，由于儀器昂貴，普及有一定難度。故筆者參考有關(guān)資料，采用蒸發(fā)光散射-HPLC法對硫酸妥布霉素注射液中的有關(guān)物質(zhì)進行了探索性考察。

1 儀器與試藥

LC-2010 A型HPLC儀（日本島津公司）；ELSD2000型蒸發(fā)光散射檢測器（美國Alltech科技公司）；Phenomenex Syregy C18色譜柱（250 mm×4.60 mm，5μm）、Phenomenex Gemini-NX C18色譜柱（250 mm×4.60 mm，5μm）、Phenomenex Luna C18色譜柱（250 mm×4.60 mm，5μm）。

三氟乙酸（國藥集團化學試劑有限公司，分析純，批號：F20071220）；妥布霉素對照品（批號：130527-200402，含量：91.4%）、卡那霉素B對照品（批號：130548-200501）、新霉胺對照品（批號：130411-200307）均來自中國食品藥品檢定研究院；暗霉胺由天津市藥檢所提供；硫酸妥布霉素注射液89批，分別來源于湖北天藥藥業(yè)股份有限公司等14家企業(yè)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18柱；流動相：0.2 mol·L－1三氟乙酸溶液；流速：0.4 mL·min－1；蒸發(fā)光散射檢測器；飄移管溫度：110℃；載氣流量：3.0 L·min－1。

2.2 雜質(zhì)定位及輔料干擾考察

取妥布霉素已知雜質(zhì)新霉胺、卡那霉素B、暗霉胺適量，按“2.1”項下的色譜條件進行雜質(zhì)定位測定。結(jié)果，各雜質(zhì)之間以及雜質(zhì)與妥布霉素均能有效分離。另，由于硫酸妥布霉素注射液的處方相對單一，只有亞硫酸氫鈉（或亞硫酸鈉）、依地酸二鈉和硫酸，故筆者對這幾種輔料的干擾均進行了檢測。各雜質(zhì)及輔料出峰典型圖譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.3 強制性破壞分離度考察試驗

取樣品適量，分別進行強制性熱破壞（60℃下放置10 d，121℃下放置30 min）、光破壞（裸置于紫外光下48 h）以及氧化破壞（樣品1 mL，加入30%雙氧水1 mL，水1 mL，反應(yīng)2 h后加水稀釋至10 mL，供檢測用），按照“2.1”項下的色譜條件進行考察。結(jié)果顯示，妥布霉素與降解雜質(zhì)能有效分離。

2.4 線性關(guān)系考察

取妥布霉素對照品0.01580 g，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，作對照液5。再取上述溶液分別加水稀釋制成14.44、28.88、46.21、101.09 μg·mL－1系列濃度的對照液1～4，將對照液1～5分別進樣，記錄峰面積。以相應(yīng)的峰面積的常用對數(shù)值與對照液濃度的常用對數(shù)值分別作為橫縱坐標，以最小二乘法計算回歸方程得：lgA=1.2156 lgC+3.139（r＝0.9954，n＝5）。結(jié)果表明，妥布霉素檢測濃度在0.14～1.01 μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 檢出限考察

以妥布霉素計，本方法檢測限為0.1072μg，定量限為0.2528μg，最小檢出濃度為5.80μg·mL－1，最小檢出限為0.14%。

2.6 對照溶液的選擇

曾有研究資料[5]顯示，不同pH的妥布霉素供試品溶液采用HPLC分析方法，用蒸發(fā)光散射檢測器檢測時，其響應(yīng)值有較大差異，如：取硫酸妥布霉素，加水溶解并稀釋制成每1 mL中含40μg妥布霉素的供試品溶液，其pH為5.08；而取妥布霉素標準品，制成相同濃度溶液時，其pH為8.70，進樣后前者峰面積響應(yīng)值為后者的2倍，為保證結(jié)果的正確性，其采用了供試品溶液稀釋的自身對照法。為此，筆者也對pH的變化對響應(yīng)值的影響進行了考察，結(jié)果見表1。

表1 pH值對妥布霉素響應(yīng)值的影響Tab 1 Effects of pH value on tobramycin response value

上述結(jié)果表明，用蒸發(fā)光散射檢測器檢測時，當妥布霉素對照品與硫酸妥布霉素注射液樣品均稀釋制成相同濃度時，盡管兩者pH相差較大，但峰的響應(yīng)值并沒有太大差異。結(jié)果表明，用蒸發(fā)光散射檢測器檢測時，供試品溶液pH對測定結(jié)果并無明顯影響，故筆者選用了對照品對照法。

2.7 不同型號色譜柱對妥布霉素與卡那霉素B分離度影響的考察試驗

根據(jù)各雜質(zhì)以及輔料定位情況，卡那霉素B與妥布霉素相鄰，為考察色譜柱填料對其分離度的影響，筆者采用不同填料的C18柱對妥布霉素與卡那霉素B的分離度進行了考察，結(jié)果見圖2～圖4。

結(jié)果顯示，該色譜系統(tǒng)對柱子的選擇性較大，同一品牌的C18柱由于其填料的細微差別，可引起其保留時間較大的變化，以致影響妥布霉素與卡那霉素B之間的分離度。

圖2 Syregy C18Fig 2 Syregy C18

圖3 Gemini-NX C18Fig 3 Gemini-NX C18

圖4 Luna C18Fig 4 Luna C18

3 討論

在該色譜條件下，硫酸根和亞硫酸根均在相對保留時間約0.46 min的位置出峰，鈉離子在相對保留時間約0.52 min的位置出峰，依地酸根在主峰前位置出峰，與卡那霉素B雜質(zhì)出峰位置重合，出峰時間相對保留時間約0.94 min，但依地酸二鈉在按處方比例加入后稀釋到測定溶液濃度（4 mg·mL－1）時，已檢測不出乙二胺四乙酸（EDTA）主峰，故對雜質(zhì)測定無影響。

強制性破壞試驗結(jié)果顯示，妥布霉素對熱穩(wěn)定性較好，其能夠耐受115℃、30 min的滅菌溫度，但121℃、30 min的過度滅菌方式雜質(zhì)個數(shù)和雜質(zhì)總量均明顯增加，對暗霉胺影響不明顯，但長時間的干熱（60℃，10 d）會引起暗霉胺的增加；其對光敏感性不強，但易氧化。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學工業(yè)出版社，2005：270.

[2]The United States Pharmacopoeia Convention.U.S.Pharmacopoeia/National Formulary[S].31.

[3]British Pharmacopoeia Commission.British Pharmacopoeia[S].2008.

[4]European Directorate for Quality Medicines.European Pharmacopoeia[S].6.0.

[5]天津市食品藥品檢驗所.《中國藥典》2010年版草案[Z].2010.