張火旺（河源市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東河源 517000）

金雞片由金櫻根、雞血藤、千斤拔、穿心蓮、功勞木、兩面針等6味中藥組成，具有清熱解毒、健脾除濕、通絡(luò)活血等作用，通常用于濕熱下注引起的附件炎。金雞片的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[1]只收載了定性鑒別反應(yīng)，有文獻(xiàn)[2]報道采用HPLC法測其中功勞木的含量，但原兒茶酸含量測定未見文獻(xiàn)報道。為進(jìn)一步提高該藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，需建立金雞片中雞血藤的原兒茶酸含量測定方法。筆者參考文獻(xiàn)[3]方法，采用高效液相色譜（HPLC）法測定金雞片中原兒茶酸的含量，簡便、準(zhǔn)確，分離度好，可用于該產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

LC-2010 AHT型HPLC儀、UV-2450型紫外分光光度計（日本島津公司）；AG-135電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-250 D超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

原兒茶酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110809-200604，含量：100%）；金雞片（廣東益和堂制藥有限公司，批號：20100301、20100602、KC008，每片含干膏粉 0.247 g）；甲醇（山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司，色譜純，批號：20100827282）；冰醋酸（廣州化學(xué)試劑廠，分析純，批號：20100301-1）；乙酸乙酯（廣州化學(xué)試劑廠，分析純，批號：20100703-2）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠Inertsil C18柱（250mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-水-冰醋酸（v/v＝25∶75∶0.2）；檢測波長：260nm；流速：0.8mL·min－1；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：30℃。采用峰面積外標(biāo)法定量[4]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品貯備液的制備 精密稱取原兒茶酸對照品10.50 mg，置于100 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解至刻度，搖勻，作為原兒茶酸對照品貯備液（濃度為105μg·mL－1）。

2.2.2 供試品溶液的制備 取金雞片20片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)（過3號篩），精密稱取0.6275 g，加0.1 mol·L－1的鹽酸1 mL，再精密加入乙酸乙酯50 mL，超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）30 min，濾過，精密量取續(xù)濾液25.0 mL，蒸干，殘渣加50%甲醇適量超聲5 min使溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中處方比例同法制備不含雞血藤的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下的制備方法處理得陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取對照品貯備液、供試品溶液、陰性對照溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測繪HPLC圖譜，理論板數(shù)按原兒茶酸計算不低于5000，分離度為4.68，陰性對照液在組分的出峰時間區(qū)域無干擾峰。結(jié)果表明，處方中其他成分及輔料對供試品的測定無干擾作用。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取原兒茶酸對照品貯備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，置于100mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度并搖勻，配成原兒茶酸濃度為 1.050、2.100、3.150、4.200、5.250、6.300μg·mL－1的溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10μL，測定峰面積。結(jié)果，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以原兒茶酸進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝4101676.19 X+2308.07（r＝0.9994，n＝6）。結(jié)果表明，原兒茶酸進(jìn)樣量在0.0105～0.0630μm范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

取同一對照品貯備液適量，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量10μL，測定峰面積。結(jié)果，RSD＝0.45%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號（批號：20100301）樣品適量，共6份，照“2.2.2”項(xiàng)下方法處理并測定含量。結(jié)果，RSD＝1.02%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品溶液適量，于室溫放置，每隔2 h測定1次，連續(xù)測定6次。結(jié)果，原兒茶酸含量的RSD＝0.81%（n＝6），表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批號樣品（批號：20100301，原兒茶酸含量：0.4480 mg·g－1，平均每片重：0.3136 g）適量，共6份，分別加入對照品貯備液（原兒茶酸：0.105 mg·mL－1）1 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣各10μL，測定，計算原兒茶酸的加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.9 樣品含量測定

取3批金雞片，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取對照品貯備液（3.15μg·mL－1）和供試品溶液各10μL，注入HPLC儀，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，按外標(biāo)法計算樣品中原兒茶酸的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3.1 檢測波長的選擇

取原兒茶酸對照品適量，用流動相為溶劑溶解，經(jīng)紫外-可見分光光度計在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，原兒茶酸在260 nm波長下有最大吸收，靈敏度高，故選擇260 nm作為檢測波長。

3.2 流動相的選擇

原兒茶酸屬有機(jī)酸，極性較大，選擇反相色譜法，流動相選擇甲醇-水（v/v＝15∶85）的體系，出峰時間較長，且峰形較寬；選用甲醇-水（v/v＝25∶75）的體系，出峰時間適中，峰形仍較寬；選用甲醇-水-冰乙酸（v/v＝25∶75∶0.2）的體系，出峰時間約為9 min，峰形尖銳，理論板數(shù)達(dá)到5000以上，達(dá)到分離要求，故選擇甲醇-水-冰乙酸（v/v＝25∶75∶0.2）為流動相。

3.3 提取方法的選擇

采用50%、80%甲醇索氏提取4 h，50%、80%甲醇回流提取2 h，醋酸乙酯超聲30 min，醋酸乙酯加水（1∶1）超聲30 min，水提醇沉后乙酸乙酯萃?。话l(fā)現(xiàn)水提醇沉后乙酸乙酯萃取的方法，含量較高且分離度也好，但是萃取過程中的重復(fù)性差，考慮到有機(jī)酸在酸性水中用乙酸乙酯萃取效果較好[5]，用少量0.1 mol·L－1鹽酸加乙酸乙酯直接超聲的方法，獲得了含量較高且分離度也好的結(jié)果。

綜上所述，本法專屬性強(qiáng)，簡便準(zhǔn)確，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，加樣回收率符合要求。幾批次含量相差較大，這可能與原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對這種成分無含量控制有關(guān)，因此本法的建立有利于更好地控制該藥品質(zhì)。

[1]WS3-B-3432-98.1998.金雞片標(biāo)準(zhǔn)[S].

[2]丘明明.HPLC法測定金雞片中3種生物堿的含量[J].中國藥物分析雜志，2011，31（5）：927.

[3]黃燦輝.HPLC法測定不同產(chǎn)地雞血藤中原兒茶酸的含量[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，15（3）：83.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄33.

[5]張春輝，吳愛英，楊曉云.壯腰健腎片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[J].中國藥師，2006，9（12）：1121.