尚德志，張麗艷，汲坤，沈薇，牟均

（沈陽醫(yī)學(xué)院1.口腔醫(yī)學(xué)院頜面外科；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室；3.國資處，沈陽11003 4）

電壓門控鉀通道（Kv）由電壓感受器（S1-S4）和孔道區(qū)域（S5-P-S6）組成。傳統(tǒng)的電壓門控機(jī)制Shaker模型建立在大量電生理數(shù)據(jù)基礎(chǔ)之上，認(rèn)為S3-S4是跨膜片段，S4因帶有大量電荷，位于由S1-S3片段及相鄰亞單位的S5組成的水性環(huán)境中間［1］。隨著古細(xì)菌電壓門控KvAP蛋白X-ray結(jié)晶的成功，學(xué)者們又提出了1個(gè)新的電壓門控機(jī)制模型，即KvAP模型。該模型認(rèn)為S3-S4形成1個(gè)槳狀物，游離于孔道區(qū)域之外，靜息狀態(tài)時(shí)，平行于膜的內(nèi)表面，除極化時(shí)，通過杠桿式外移轉(zhuǎn)為跨膜片段［2］。兩大機(jī)制模型分歧的焦點(diǎn)在于電壓感受器S4的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，如S4在膜中所處的位置，S4與其他跨膜片段的空間位置關(guān)系等。膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析是研究膜蛋白的各個(gè)跨膜片段在蛋白合成的同時(shí)如何整合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，并最終形成什么樣的跨膜結(jié)構(gòu)。糖基化反應(yīng)常被用來分析膜蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)［3］，而糖基化反應(yīng)是否有效進(jìn)行取決于其糖基化受體位點(diǎn)是否符合12-14規(guī)則［4］，此規(guī)則已被用來分析膜蛋白跨膜區(qū)的邊界［5］。本研究采用膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析和糖基化掃描方法分析了Kv家族中具有代表性的Shaker通道的電壓感受器S3-S4的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，旨在推斷其在膜中所處的位置，為分析電壓門控機(jī)制提供了結(jié)構(gòu)上的信息。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒構(gòu)建

采用2步PCR方法，去除Shaker通道的N端，以增加該蛋白的體外合成效率，同時(shí)通過點(diǎn)變異的方式去除Shaker通道位于S1-S2連接中的2個(gè)內(nèi)源性糖基化受體位點(diǎn)N259和N263，然后把來自于人帶3蛋白中含有1個(gè)糖基化受體位點(diǎn)的G-loop插入到S3-S4連接中，以分析S3-S4的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，最后把編碼ShakerS1-S4（K198-F401）區(qū)域的DNA融合到攜帶有PL報(bào)告基因的pCITE-2a載體（No－vagen，Madison，WI）中（圖1A）。

1.2 無細(xì)胞系統(tǒng)蛋白轉(zhuǎn)錄、翻譯及轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

將所有質(zhì)粒通過ScaI酶切線性化，在標(biāo)準(zhǔn)條件下利用T7 RNA多聚酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，37℃，1 h。把獲得的mRNA在含有或不含有狗胰腺粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡（rough microsome，RM）的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞抽出液系統(tǒng)中進(jìn)行體外蛋白合成和轉(zhuǎn)運(yùn)，30℃，1 h。采用蛋白激酶K對(duì)在含有RM條件下合成的蛋白產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行蛋白水解實(shí)驗(yàn)，用［35S］蛋氨酸標(biāo)記蛋白，SDS-PAGE電泳分離蛋白產(chǎn)物，最后進(jìn)行同位素自顯影。

1.3 糖基化掃描方法

在已獲得有效糖基化的ShakerS1-S4構(gòu)建體基礎(chǔ)上，把NSS受體位點(diǎn)分別引進(jìn)到S3-S4連接的不同位置（圖2A），然后根據(jù)糖基化的有無及其程度和12-14規(guī)則來推測可能的S3、S4跨膜末端。糖基化效率由糖基化的蛋白帶的強(qiáng)度除以糖基化蛋白帶與未被糖基化的蛋白帶強(qiáng)度之和計(jì)算獲得。有效的糖基化效率定義為至少應(yīng)該達(dá)到最大糖基化效率的一半，突然的糖基化效率下降可視為該糖基化位點(diǎn)超出所謂的12-14距離。

2 結(jié)果

2.1 Shaker中S1-S4的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析

在未添加RM的條件下，ShakerS1-S4-PL經(jīng)體外合成后，出現(xiàn)1條分子量約為50 kDa的蛋白帶，這是未被糖基化的蛋白帶（圖1B）。在RM存在的條件下，出現(xiàn)1條明顯的糖基化蛋白帶，分子量比未被糖基化的蛋白帶多出約3 kDa。在RM存在條件下獲得的蛋白經(jīng)過蛋白激酶K處理后，所有蛋白帶消失。提示Shaker的S3-S4能被有效地轉(zhuǎn)移整合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，S3是以Ncyt/Cexo的方向，S4是以Ncyt/Cexo的方向插入到膜上的（圖1C）。

2.2 Shaker中S3、S4片斷末端氨基酸殘基分析

圖2B為糖基化掃描的SDS-PAGE結(jié)果，其糖基化效率見圖3A。NSS位點(diǎn)在G20的構(gòu)建體是基礎(chǔ)質(zhì)粒（同圖1），其糖基化效率（36.0%±1.8%）與圖1相似，為有效糖基化。第1個(gè)被糖基化的受體位點(diǎn)位于殘基342，其糖基化效率為28.0%±2%；最后1個(gè)被糖基化的受體位點(diǎn)位于殘基345，其糖基化效率為18.0%±0.8%，說明這2個(gè)受體位點(diǎn)恰好位于能與寡糖基轉(zhuǎn)移酶的活性位點(diǎn)結(jié)合的最短距離。雖然最后幾個(gè)糖基化位點(diǎn)的效率偏低，但均能達(dá)到最大效率的50%，G38位點(diǎn)除外。根據(jù)12-14規(guī)則，可推測出Shaker中S3-S4跨膜片段的末端氨基酸位置（圖3C）。Shaker通道中，S3的C端位于T329，S4的N端位于L358。

2.3 Shaker中S3、S4片段膜中位置分析

SOSUI疏水性分析發(fā)現(xiàn)S3的N端起始于V311，C 端終止于 T329；S4的 N 端起始于 L358，C端終止于R377，見圖3B。其S3的C端殘基和S4的N端殘基與圖3C推測出的數(shù)據(jù)一致，由此推論Shaker的S3與S4均為跨膜片段。

3 討論

目前，常利用無細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行膜蛋白的體外轉(zhuǎn)錄、翻譯和轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，然后根據(jù)合成的蛋白肽鏈?zhǔn)欠癜l(fā)生糖基化反應(yīng)，以及是否被蛋白水解酶降解等特點(diǎn)，分析膜蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)［3］。蛋白肽鏈的糖基化反應(yīng)通常在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔內(nèi)進(jìn)行，在寡糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，1個(gè)糖基化受體位點(diǎn)（Nsn-X-Ser/Thr，其中X為任何一種氨基酸）接受1個(gè)高甘露糖基寡聚糖，其分子量會(huì)增加2.5 kDa。圖1B中，在RM存在的條件下，糖基化蛋白帶的出現(xiàn)說明S3-S4連接位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)（細(xì)胞外），所以其人工導(dǎo)入的G-loop上的糖基化受體位點(diǎn)才能被糖基化。糖基化效率為（37.0±2.0）%，說明該位點(diǎn)被有效地糖基化。位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的蛋白肽鏈除了可發(fā)生糖基化反應(yīng)外，因受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的保護(hù)，不會(huì)被蛋白水解酶降解。圖1B中，在RM存在下獲得的蛋白肽鏈經(jīng)過蛋白激酶K處理后，所有蛋白帶消失，說明S1-S4蛋白肽鏈C端（含報(bào)告蛋白PL）位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔外（細(xì)胞內(nèi)），因而被蛋白激酶K消化降解。由這些結(jié)果推斷出S3是以Ncyt/Cexo的方向，S4是以Ncyt/Cexo的方向整合到膜上的。

膜蛋白的糖基化反應(yīng)是否有效進(jìn)行取決于膜蛋白的糖基化受體位點(diǎn)能否與膜上寡糖基轉(zhuǎn)移酶的活性位點(diǎn)結(jié)合，而該活性位點(diǎn)距內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜有一定的距離。1993年Nilsson等［4］利用大腸桿菌前導(dǎo)肽酶提出了12-14規(guī)則，認(rèn)為糖基化受體位點(diǎn)的N端距內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表面至少有12個(gè)殘基的距離，C端至少有14個(gè)殘基的距離，才能被有效糖基化［4］。

本研究通過糖基化掃描的方法，根據(jù)12-14規(guī)則，推測出ShakerS3-S4片段的細(xì)胞外末端氨基酸殘基，并由此推測出其在膜中可能的位置。因?yàn)槟さ鞍自趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)的同時(shí)進(jìn)行折疊，形成蛋白的3級(jí)結(jié)構(gòu)，因而其膜整合的一些結(jié)構(gòu)信息可能代表著膜蛋白的最終結(jié)構(gòu)信息。目前，對(duì)于Kv通道電壓門控機(jī)制的研究主要集中在電生理和X-ray結(jié)晶方面［6，7］，本研究試圖從膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析的角度對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。我們的糖基化掃描結(jié)果認(rèn)為Shaker的S3、S4為跨膜片斷，與傳統(tǒng)的Shaker電壓門控機(jī)制模型一致，為電壓門控機(jī)制的研究提供了線索。

［1］Heginbotham L，Lu Z，Abramson T，et al.Mutations in the K+channel signature sequence［J］.Biophys J，1994，66（4）：1061-1067.

［2］Ahern CA，Horn R.Stirring up controversy with a voltage sensor paddle［J］.Trends Neurosci，2004，27（6）：303-307.

［3］Zhang L，Sato Y，Hessa T，et al.Contribution of hydrophobic and electrostatic interactions to the membrane integration of the Shaker K+channel voltage sensor domain ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（20）：8263-8268.

［4］Nilsson IM，von Heijne G.Determination of the distance between the oligosaccharyltransferase active site and the endoplasmic reticulum membrane［J］.J Biol Chem，1993，268（8）：5798-5801.

［5］Popov M，Tam LY，Li J，et al.Mapping the ends of transmembrane segments in a polytopic membrane protein.Scanning N-glycosylation mutagenesis of extracytosolic loops in the anion exchanger，band3［J］.J Biol Chem，1997，272（29）：18325-18332.

［6］Koag MC，Papazian DM.Voltage-dependent conformational changes of KVAP S4 segment in bacterial membrane environment［J］.Channels（Austin），20093（5）：356-365.

［7］Schow EV，F(xiàn)reites JA，Gogna K，et al.Down-state model of the voltage-sensingdomainofapotassiumchannel［J］.BiophysJ，2010，98（12）：2857-2866.