張忠提，張雪，李瑞武

（中國醫(yī)科大學(xué)1.口腔醫(yī)學(xué)院干診科；2.口腔醫(yī)學(xué)院中心實驗室；3.遼寧省口腔醫(yī)學(xué)研究所；4.口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科，沈陽110002）

牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cell，DPSC）在牙齒的修復(fù)再生研究中扮演重要角色［1］。Notch、Wnt等多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可調(diào)節(jié)DPSC的增殖及分化。其中Wnt信號通路在牙齒發(fā)育的信號調(diào)控和牙齒再生等醫(yī)學(xué)工程研究中發(fā)揮重要作用。Wnt信號途徑中的重要因子Wnt1、腺瘤樣息肉蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）可影響牙上皮和間充質(zhì)的相互作用及牙本質(zhì)與牙根的發(fā)育、增殖和分化［2］。我們前期實驗［3］發(fā)現(xiàn)大鼠牙乳頭細(xì)胞在體外與DPSC分層共培養(yǎng)可促進(jìn)DPSC的增殖能力，為探討這一生物學(xué)過程的細(xì)胞內(nèi)分子機制，我們檢測了牙乳頭細(xì)胞和DPSC分層共培養(yǎng)后Wnt通路的表達(dá)情況。

本研究擬用原代培養(yǎng)大鼠DPSC與牙乳頭細(xì)胞建立DPSC和牙乳頭細(xì)胞的分層共培養(yǎng)體系，探討牙乳頭細(xì)胞對大鼠DPSC中Wnt信號分子表達(dá)的影響，為DPSC增殖方面的研究提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Sprague-Dawley健康雄性4周齡大鼠和Sprague-Dawley出生后1 d大鼠，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清購自Gibco 公司；Wnt1、APC、β-catenin 一抗 購自 Santa Cruz公司。二抗購自北京中山生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 DPSC和牙乳頭細(xì)胞分層共培養(yǎng)體系建立：參照文獻(xiàn)［4，5］原代培養(yǎng)大鼠DPSC和牙乳頭細(xì)胞，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。PBS清洗3次，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，加入含血清培養(yǎng)基，將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上吹落并分散成單細(xì)胞懸液。將Transwell小室放入24孔板中，分層培養(yǎng)組下室接種DPSC，上室接種牙乳頭細(xì)胞，培養(yǎng)基為10%胎牛血清的DMEM/F12，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗隨機分為DPSC培養(yǎng)對照組、DPSC+牙乳頭細(xì)胞分層培養(yǎng)體系組、分層培養(yǎng)體系組+DKK-1組（DKK-1終濃度為50 ng/mL，作用48 h）。

1.2.2 DPSC及牙乳頭細(xì)胞免疫組化鑒定：24孔板內(nèi)細(xì)胞經(jīng)PBS清洗后，4%多聚甲醛中4℃固定24 h。PBS漂洗3次。滴加0.1%Triton X-10050 μL，室溫放置8 min。PBS漂洗3次。3%H2O2室溫孵育15 min，山羊血清封閉，室溫孵育15 min。一抗孵育：兔抗鼠牙本質(zhì)涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP）1∶100，兔抗鼠波形絲蛋白（vimentin）1∶100，兔抗鼠角蛋白（cytokeratin）1∶150。生物素標(biāo)記山羊抗兔二抗孵育后。辣根酶標(biāo)記，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、鏡檢。

1.2.3 RT-PCR 法 檢 測 DPSC 中 Wnt1、APC、βcateninmRNA的表達(dá)：各組細(xì)胞培養(yǎng)5 d后，提取細(xì)胞總RNA，將得到的RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以得到對應(yīng)的cDNA。建立PCR反應(yīng)體系，引物信息如表1，PCR 反應(yīng)程序如下：95℃變性5 min，95℃20 s，60℃20 s，72℃30 s共30個循環(huán)，72℃延長5 min。然后瓊脂糖凝膠電泳，利用Bio-Rad凝膠成像儀成像和Fluor Chen V2.0 Stand Alone軟件對圖像進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參照，結(jié)果以整合光密度值（integrated density value，IDV）比值表示。

1.2.4 Western blot方法檢測 DPSC中 Wnt1、APC、β-catenin蛋白的表達(dá)：各組細(xì)胞培養(yǎng)5 d后，PBS沖洗，加入RIPA裂解液收集細(xì)胞，4℃、12000 r/min離心10 min，取上清液采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取各組的等量蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%的脫脂奶粉封閉2 h后，按不同比例稀釋的一抗中4℃孵育過夜。經(jīng)TTBS充分洗膜后，二抗孵育45 min。ECL底物發(fā)光顯色。以β-actin為內(nèi)對照，所得圖像掃描后，采用Fluor Chen2.0軟件進(jìn)行定量分析，測得IDV值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DPSC及牙乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

大鼠DPSC為成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，多數(shù)呈長梭形，細(xì)胞核較大。牙乳頭細(xì)胞，形態(tài)可呈多角形、三角形等，細(xì)胞體積較小。牙乳頭細(xì)胞胞質(zhì)中Cytokeratin染色陰性、Vimentin染色陽性。DPSC中DSP染色陰性、Vimentin染色陽性，見圖1。

2.2 RT-PCR結(jié)果

結(jié)果顯示：分層共培養(yǎng)組較DPSC培養(yǎng)對照組Wnt1、β-cateninmRNA 的表達(dá)顯著增強（P<0.01）。DPSC和牙乳頭細(xì)胞分層培養(yǎng)下，給予Wnt信號通路抑制劑DKK-1干預(yù)DPSC，結(jié)果顯示DPSC中Wnt1、β-cateninmRNA的表達(dá)與未干預(yù)組比較均顯著降低（P<0.01）。而分層共培養(yǎng)組中APCmRNA與DPSC培養(yǎng)組或給予DKK-1組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

2.3 Western blot結(jié)果

與DPSC培養(yǎng)對照組比較，分層共培養(yǎng)組Wnt1、β-catenin蛋白的表達(dá)顯著增強（P<0.01）。給予DKK-1干預(yù)DPSC后，分層共培養(yǎng)組DPSC中Wnt1、β-catenin蛋白的表達(dá)較未給予抑制劑組顯著降低（P<0.01）。分層共培養(yǎng)組中APC蛋白與DPSC培養(yǎng)對照組或給予DKK-1組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見圖3。

3 討論

本研究RT-PCR和Western blot實驗結(jié)果顯示大鼠牙乳頭細(xì)胞和DPSC分層共培養(yǎng)5 d后，牙乳頭細(xì)胞和DPSC分層共培養(yǎng)可顯著增加DPSC中Wnt信號分子Wnt1、β-catenin基因和蛋白的表達(dá)，提示W(wǎng)nt信號通路的激活可能參與了牙乳頭細(xì)胞促進(jìn)DPSC的增殖作用。

目前各種義齒仍然是缺失牙齒的主要修復(fù)方法，但它們也存在各種問題［6］，而牙齒的再生是目前口腔醫(yī)學(xué)中面臨的難題之一，它對于口腔醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的發(fā)展具有劃時代的意義。盡管人們利用生物組織工程技術(shù)進(jìn)行器官再造、組織再生及牙齒再生已經(jīng)多年，但是目前全球牙齒再生的研究現(xiàn)狀還遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到能夠提供組織工程牙齒供臨床應(yīng)用［7］。種子細(xì)胞是牙齒組織工程的重要條件，可用于牙齒組織工程的細(xì)胞來源有DPSC、牙源性外胚間充質(zhì)細(xì)胞等。DPSC位于牙髓組織內(nèi)，具有自我更新的能力，可分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞。研究表明，影響DPSC增殖分化的因素包括堿性成纖維生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、骨形成蛋白、β-磷酸甘油、Dentonin 等［8，9］。有文獻(xiàn)報道［10］牙乳頭中存在能分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞的干細(xì)胞。將牙乳頭細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng)，不僅可以分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，還可以誘導(dǎo)形成牙本質(zhì)基質(zhì)。我們前期實驗［3］證實大鼠牙乳頭細(xì)胞和DPSC分層共培養(yǎng)，牙乳頭可能分泌一些可溶性因子促進(jìn)DPSC的增殖、礦化，并增加一些重要成牙標(biāo)志性蛋白的表達(dá)。提示牙乳頭細(xì)胞可能通過某種作用機制促進(jìn)了DPSC的增殖、分化程度。

為了進(jìn)一步探討Wnt信號分子是否參與了牙乳頭細(xì)胞促進(jìn)DPSC增殖作用的這一生物學(xué)過程，我們檢測了一些重要Wnt信號分子。Wnt基因家族編碼一類結(jié)構(gòu)相似的分泌型蛋白，Wnt信號蛋白與細(xì)胞表面Frizzled受體作用，啟動下游信號級聯(lián)反應(yīng)，實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)外的信息傳遞，Wnt基因調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在胚胎發(fā)育、器官形成、牙齒發(fā)育中均起重要作用。Wnt信號通路的主要成員包括Wnt蛋白配體、Wnt受體、β-catenin、糖原合成酶激酶、軸蛋白、APC。β-catenin是Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要中介物，APC在Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中亦起重要作用。Wnt/βcatenin屬于典型Wnt通路的胞內(nèi)信號通路。研究發(fā)現(xiàn)在牙上皮和間充質(zhì)的相互作用以及牙本質(zhì)、牙根的發(fā)育過程中，Wnt信號都發(fā)揮著不可替代的作用［11，12］。本研究利用RT-PCR方法檢測牙乳頭細(xì)胞和DPSC分層共培養(yǎng)組中Wnt1、APC和β-catenin mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Wnt1、β-catenin基因表達(dá)在共培養(yǎng)組中顯著增強，我們又應(yīng)用Western blot方法檢測了分層共培養(yǎng)組中Wnt1、APC和β-catenin蛋白的表達(dá)，Western blot結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致。

綜上所述，DPSC和牙乳頭細(xì)胞分層共培養(yǎng)時可能通過激活Wnt信號通路中Wnt1、β-catenin促進(jìn)DPSC的增殖作用。但確切的細(xì)胞內(nèi)分子機制有待進(jìn)一步研究。

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