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        TiC/Ti復(fù)合泡沫材料對(duì)細(xì)胞增殖和分化的影響

        2012-12-03 08:09:14劉笑涵吳琳張勁松高勇鐘鳴
        關(guān)鍵詞:成骨細(xì)胞分子篩涂層

        劉笑涵,吳琳,張勁松,高勇,鐘鳴

        (1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院修復(fù)科,遼寧省口腔醫(yī)學(xué)研究所,沈陽110002;2.中國(guó)科學(xué)院金屬研究所,沈陽110016;3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室,沈陽110002)

        近年來,具有良好生物相容性和安全性的人工關(guān)節(jié)的開發(fā)已成為研究的熱點(diǎn)[1]。鈦材料因其低密度、良好的耐腐蝕能力、比強(qiáng)度高以及令人滿意的生物相容性成為應(yīng)用最為廣泛的人工關(guān)節(jié)材料,但鈦材料的低表面硬度,低抗磨損能力,制約了其發(fā)展[2]。而TiC化合物具有很高的硬度和耐磨性,將TiC加入鈦材料除了可進(jìn)一步提高材料的比彈性模量、比強(qiáng)度和抗蠕變能力外,最明顯的是提高鈦材料的耐磨性能。TiC/Ti復(fù)合泡沫材料(TiC/Ti)為生物惰性材料,為了增加其表面活性,制備了表面經(jīng)氧化處理的TiC/Ti(TiO2/TiC/Ti)和表面經(jīng)ZSM-5分子篩修飾的TiC/Ti(ZSM-5/TiC/Ti)。本課題組前期研究證實(shí)泡沫碳化硅(SiC)具有良好的生物相容性[3],可以促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)[4],并且有良好的骨傳導(dǎo)性[5]。本實(shí)驗(yàn)以SiC為陰性對(duì)照,將TiC/Ti、TiO2/TiC/Ti、ZSM-5/TiC/Ti材料與SiC進(jìn)行比較,研究這3種實(shí)驗(yàn)材料對(duì)細(xì)胞增殖和分化的影響,旨在為新型人工關(guān)節(jié)材料的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料及分組

        實(shí)驗(yàn)分為 4 組:TiC/Ti組、TiO2/TiC/Ti組、ZSM-5/TiC/Ti組、陰性對(duì)照SiC組。4種材料均為直徑14 mm、厚2 mm的圓片,平均孔徑1mm,孔隙率80%(中國(guó)科學(xué)院金屬研究所制備)。用75%乙醇超聲清洗,40 Hz,5 min,烘干,高溫高壓(134 ℃、0.21 MPa)滅菌處理。

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):將滅菌處理后的4種材料分別加入培養(yǎng)液,置于 CO2培養(yǎng)箱(37℃,5%CO2)中培養(yǎng)24 h,制備出材料浸提液[6],試件浸提量與試樣質(zhì)量比為0.2 g/mL[7]。將濃度為1×104/mL 的 L929細(xì)胞(由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供)懸液接種于96 孔板,每孔100 μL,每組10 孔。培養(yǎng)24 h,PBS 沖洗后,分別用A~E組液體置換,培養(yǎng)1,3,5 d后取出。加入50 μL/孔濃度為5 mg/mL的MTT液,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,吸去原液,加入150 μL/孔的 DMSO[8],振蕩10 min,在免疫酶儀上以550 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度,并計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)增殖度(RGR):RGR=實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值/陰性對(duì)照組平均光密度值×100%。

        1.2.2 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn):將滅菌備用的4組材料置入24孔培養(yǎng)板中,將濃度為2×104/mL的小鼠成骨細(xì)胞MC3T3(由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供)懸液,接種到各樣品表面,置于37℃,5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)1,3,5 d后取出,用0.l mol/L的PBS漂洗后放入2.5%戊二醛中固定24 h,1%鋨酸固定1 h,然后將試樣再次用PBS漂洗,隨后依次乙醇系列梯度脫水、CO2臨界點(diǎn)干燥、噴金后[9],在掃描電子顯微鏡(Quanta600,中國(guó)科學(xué)院金屬研究所)觀察材料表面細(xì)胞的形態(tài)。

        1.2.3 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)含量測(cè)定:將2×104/mL的MC3T3成骨細(xì)胞懸液接種于24孔板的各組材料表面,分別培養(yǎng)1,3,5 d后,將細(xì)胞消化下來,超聲破碎儀破碎后,取樣。用ALP試劑盒(南京凱基生物公司)檢測(cè)ALP含量,以酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在520 nm處測(cè)定光密度值(optical delnsity,OD)。依據(jù)公式 ALP(U/gprot)=測(cè)定管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度×標(biāo)準(zhǔn)管含酚的量(0.003 mg)/取樣量中的蛋白(g),計(jì)算MC3T3的平均ALP活性。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        2 結(jié)果

        2.1 細(xì)胞增殖結(jié)果

        結(jié)果可見,L929細(xì)胞在3種材料浸提液中均能生長(zhǎng),且隨時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增多。TiC/Ti、TiO2/TiC/Ti、ZMS-5/TiC/Ti組和SiC組間細(xì)胞量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)比較分析,與SiC比較,在1 d 時(shí),TiO2/TiC/Ti>SiC(P <0.05),而 TiC/Ti、ZSM-5/TiC/Ti組的細(xì)胞量與SiC相近(P>0.05);在3 d時(shí),SiC>ZSM-5/TiC/Ti(P <0.05),TiC/Ti>SiC(P <0.05),TiO2/TiC/Ti組的細(xì)胞量與SiC組相近(P>0.05);在5 d 時(shí),TiC/Ti、TiO2/TiC/Ti>SiC(P <0.05),SiC>ZSM-5/TiC/Ti(P<0.05),見表1。

        與SiC組比較,TiC/Ti組增殖率和增殖速度隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高;TiO2/TiC/Ti增殖率不斷升高,增殖速度在3 d時(shí)減緩后加快;而ZSM-5/TiC/Ti增殖率低于SiC,而且增殖速度不斷下降,見表2。

        2.2 細(xì)胞黏附試驗(yàn)

        掃描電鏡觀察可見:3種實(shí)驗(yàn)材料與陰性對(duì)照SiC組表面均有MC3T3細(xì)胞黏附,并隨觀察時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增多,貼壁伸展的MC3T3細(xì)胞表面具有許多突起,并伸出較多的絲狀、纖維狀偽足,有的細(xì)胞將偽足伸向孔徑的內(nèi)部,細(xì)胞間靠偽足相連,3 d開始出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積,而5 d可見明顯的細(xì)胞外基質(zhì)沉積,細(xì)胞包繞在細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi),細(xì)胞邊界逐漸模糊。3種實(shí)驗(yàn)材料表面上黏附的MC3T3細(xì)胞形態(tài)與陰性對(duì)照SiC組沒有明顯差別,見圖1。

        2.3 ALP含量結(jié)果(表3)

        結(jié)果可見,隨時(shí)間延長(zhǎng),各組ALP含量逐漸增加。TiC/Ti、TiO2/TiC/Ti、ZMS-5/TiC/Ti組和 SiC 組間ALP含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。經(jīng)單因素方差分析,組間比較ALP含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)比較分析,與SiC組比較,ALP含量在1 d時(shí),TiC/Ti稍高于 SiC,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),TiO2/TiC/Ti>SiC( P<0.05),SiC>ZSM-5/TiC/Ti(P <0.05);在3 d 時(shí),TiC/Ti、TiO2/TiC/Ti>SiC(P <0.05),SiC>ZSM-5/TiC/Ti(P <0.05);在5 d 時(shí),TiC/Ti>SiC(P<0.05),TiO2/TiC/Ti稍高于 SiC,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P >0.05),SiC>ZSM-5/TiC/Ti(P <0.05)。

        3 討論

        從細(xì)胞增殖、細(xì)胞黏附和ALP含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,3種實(shí)驗(yàn)材料的生物相容性與SiC比較,TiC/Ti和 TiO2/TiC/Ti均優(yōu)于 SiC,ZSM-5/TiC/Ti低于SiC。研究表明:鈦材料表面的TiC涂層能夠提高材料表面穩(wěn)定性、植入材料的生物相容性[10]及成骨細(xì)胞的活性,促進(jìn)細(xì)胞在植入體表面的黏附[11],這可能是本實(shí)驗(yàn)中TiC/Ti促進(jìn)細(xì)胞增殖以及成骨細(xì)胞分化的原因。TiO2涂層可增加材料的比表面積,提高材料表面的生物活性[12],其納米級(jí)表面,相對(duì)于微米級(jí)表面會(huì)吸附更多的蛋白,成骨細(xì)胞的吸附率很高[13],而且TiO2涂層在潮濕的環(huán)境下,表面會(huì)形成一些活性羥基,這些Ti-OH基團(tuán)可以成為Ca、P離子的沉積位點(diǎn)[14],因此推斷TiC/Ti表面氧化處理形成的TiO2/TiC/Ti有利于細(xì)胞的增殖和分化,但是由于Ti-OH基團(tuán)形成鈣、磷離子沉積位點(diǎn)需要一定的時(shí)間,有可能導(dǎo)致細(xì)胞的增殖速率由慢到快。TiC/Ti表面經(jīng)ZSM-5分子篩修飾后形成的ZSM-5/TiC/Ti具有較高的熱穩(wěn)定性、抗酸性、水熱穩(wěn)定性、優(yōu)良的催化性能[15]及良好的生物相容性,但是可能由于在高溫或存在高溫水蒸汽的環(huán)境中,硅鋁分子篩出現(xiàn)骨架脫鋁現(xiàn)象使分子篩的活性下降、不穩(wěn)定[16],使細(xì)胞增殖的速率變緩,細(xì)胞分化能力低于SiC。

        綜上所述,TiC/Ti、TiO2/TiC/Ti及其降解產(chǎn)物可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化,具有良好的生物相容性,加上其優(yōu)良的耐磨性能和機(jī)械性能,作為人工關(guān)節(jié)材料具有可行性,而ZSM-5/TiC/Ti還需進(jìn)一步探討及研究。

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