劉愛東，成 敏

(1．遵義醫(yī)學院生理學教研室，貴州 遵義 563099;2．濰坊醫(yī)學院生理學教研室，山東 濰坊 261041)

糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)是排除了高血壓、冠心病及其它已知疾病所致的心肌損傷而獨立存在的病理生理狀態(tài)，表現(xiàn)為心肌肥大，心臟收縮和(或)舒張功能障礙。其發(fā)病機制尚不清楚，實驗研究指出多種代謝紊亂構成了糖尿病心肌功能和結構改變的基礎。而原癌基因的激活與表達增強是心肌肥大發(fā)生的重要途徑之一。本實驗應用鏈尿菌素(streptozocozin，STZ)誘導的糖尿病(diabetes mellitus，DM)大鼠為研究對象，通過觀察胰島素(Insulin)或燈盞花素(Breviscapine，Bre)對DM早期大鼠血糖、心肌原癌基因c－myc表達的影響，探討Insulin或Bre對糖尿病模型大鼠心肌的保護作用。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 STZ(Alexis公司);Bre(云南個舊生物藥業(yè)有限公司，規(guī)格為5mL∶20 mg);總RNA提取試劑盒和DEPC購自華美生物工程公司;ONE－STEPRT－PCR試劑盒購自Qiagen公司;血糖測定試劑盒購自四川省邁克科技有限責任公司;引物由上海生工合成。

1．2 實驗動物分組及給藥 雄性Wistar大鼠(n=48)，體重(225±26)g，購自四川大學動物中心(Ⅱ級，證書編號24101107)。大鼠適應性喂養(yǎng)一周后，用簡單隨機抽樣方法隨機選取12只為正常對照組(Normal組)，余36只禁食10 h后按(60 mg·kg－1，ip)一次性腹腔注射STZ溶液。STZ溶液臨用前用0．1 mmol·L－1枸櫞酸緩沖液(pH 4.5)配成1%濃度，Normal組注射等容積0．1 mmol·L－1枸櫞酸緩沖液。給藥48 h后經(jīng)尾靜脈采血測定空腹血糖，以血糖值≥16.65 mmol/L作為糖尿病大鼠成模標準。建模成功后，再用簡單隨機抽樣方法隨機分為糖尿病非用藥組(DM組，n=12 NC 0．2 ml·kg－1·d－1，ip)，胰島素治療組(Insulin 組，n=12，Insulin 2 U·kg－1·d－1，sv)，Bre 治療組(Bre 組，n=12，Bre 100 mg·kg－1·d－1，ip)，Normal組(n=12，NS 0．2 mL·kg－1·d－1，ip)，各組連續(xù)給藥7 d。給藥期間各組大鼠自由進水、飲食，DM組、Insulin組和Bre組各死亡1只。

1．3 實驗觀察及標本留取 各組分別在模型建立后的第1天、第3天、第7天測量血糖及稱體重。取各組第3天的大鼠(每組n=6)，在測量血糖及稱體重完畢后，以3%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后剪開胸腔，迅速摘除心臟，吸干血液后，放入液態(tài)氮中冷凍，留用RNA提取。

1．4 血糖測定 葡萄糖氧化酶法，單位以mmol/L計。

1．5 逆轉錄 －聚合酶鏈反應(RT－PCR檢測)1．5．1 心肌組織總RNA的提取 按照Trizol試劑盒說明操作，在紫外線分析儀上測定RNA濃度及A260/A280吸光度比值(1．80 ～2．12)，以確定RNA純度。

1．5．2 引物的選擇 c－myc和 β－ actin的 PCR特異性引物的選定(見表1)。

表1 PCR引物序列

1．5．3 逆轉錄 按照逆轉錄試劑盒說明書操作， 產(chǎn)物作為PCR反應的cDNA模板。

1．5．4 PCR擴增 取逆轉錄產(chǎn)物5μL作為模板進行擴增，反應體系為50μL。PCR反應條件:預變性 94℃，1 min→變性95℃，1 min→退火 c－myc 55℃，1 min→延伸72℃，1 min，共35個循環(huán)。

1．5．5 凝膠電泳 取10μl最后PCR產(chǎn)物和βactin的擴增產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖溴化乙錠染色的凝膠上運行。電泳結果用凝膠成像分析系統(tǒng)進行灰度掃描分析，c－myc mRNA的相對含量以其與β－actin(吸光度×面積)之比值表示。

1．6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 10．0統(tǒng)計軟件進行處理，資料為定量正態(tài)資料，以平均值±標準差(x±s)表示，采用重復測量的方差分析，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結果

2．1 各組大鼠體重的變化 在建模成功后第3天、第7天，DM組的大鼠體重均比Normal組的體重減輕(P＜0.05)，其余各組大鼠體重與Normal組比較無明顯變化(見表2)。

表2 各組大鼠體重的變化(x±s)

2．2 各組大鼠血糖水平的變化 在建模成功后第1天、第3天、第7天時，DM組大鼠血糖濃度均顯著高于Normal組 (P＜0.01)，Insulin組、Bre組大鼠各時間點血糖濃度均低于DM組(P＜0.01)，但高于Normal組(P＜0.01)(見表3)。

表3 各組大鼠血糖水平的比較(x±s)

2．3 原癌基因c－myc mRNA表達 在建模成功后第3天，DM組大鼠心肌c－myc mRNA表達顯著高于Normal組(P＜0.01)，Insulin組或Bre組的大鼠心肌 c－myc mRNA表達均低于 DM組(P＜0.01)，與Normal組比較無明顯差異(P＞0.05)。(見圖1、表4)

表4 各組大鼠心肌原癌基因c－myc mRNA的表達(x±s)

圖1 c－myc與β－actin電泳凝膠成像

3 討論

依據(jù)大量的流行病學、病理解剖學和動物實驗及臨床研究表明，DCM是一個獨立的原發(fā)病，是糖尿病心臟病的最早表現(xiàn)，是由糖尿病引起的與血管疾病同時伴行或單獨發(fā)生的特異性心肌?。?］。而且有研究表明:波動性高糖與單純性高糖一樣，具有促進心肌細胞肥大的作用，對DCM的發(fā)展均具有促進作用［2］。DCM主要的病理表現(xiàn)為局灶性心肌壞死、心肌肥大，細胞外基質(zhì)(ECM)沉積，細小動脈管壁增厚及纖維化，管腔狹窄，心肌纖維化，心室重量/體重比增加［3］。

c－myc是體內(nèi)編碼核內(nèi)轉錄因子，參與細胞增殖分化的調(diào)控。在新生兒和成年鼠心臟檢測出c－myc基因表達，在體外培養(yǎng)的肥大心肌細胞，檢測出高表達c－myc基因的mRNA，而c－myc基因過量表達的轉基因動物也會誘發(fā)心臟大小的增加。有研究表明:高糖可促進原癌基因c－myc和cfos的表達［4］。而活性增強的蛋白激酶 C(Protein kinase C，PKC)與細胞內(nèi)Ca2+超載，二者協(xié)同作用可致細胞內(nèi)c－myc蛋白水平增高。在糖尿病時，PKC是促使正常心肌發(fā)生病變的重要媒介，且心肌損傷的程度與PKC增強的活性呈正性相關。高血糖狀態(tài)下的氧化應激可增強PKC的活性［5］，引起Ca2+超載，離子轉運異常，從而影響心肌結構和功能。PKC的活性升高可激活調(diào)節(jié)原癌基因c－fos、c－jun等的表達，導致心肌纖維化、左心室肥大，左心室收縮及舒張功能減退［6］。

Bre是從燈盞花中提取的黃酮類成分，是燈盞花中發(fā)揮心血管作用的有效成分［7］。已有的研究顯示，Bre主要擴張血管，降低血管阻力，增加腦、腎等器官血流量，改善微循環(huán)，并有抗血小板及紅細胞聚集的作用。燈盞花素又是PKC抑制劑，在腎臟燈盞花素可通過抑制PKC活性而阻止高糖環(huán)境腎系膜細胞c－fos、c－jun蛋白表達而用于防治糖尿病腎?。?］。本研究應用STZ成功建立糖尿病大鼠模型，結果發(fā)現(xiàn)DM組大鼠在第3天、第7天的體重均比Normal組的體重減輕(P＜0.05)，在第1天，第3天、第7天的大鼠血糖濃度均比Normal組高(P＜0.01)，第3天大鼠心肌c－myc基因的mRNA表達增強，而Insulin或Bre可以分別降低血糖水平和下調(diào)c－myc基因的mRNA表達。因此，Insulin、Bre可抑制糖尿病心肌原癌基因c－myc的表達，對DCM有一定的保護作用。

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