宋凱英，徐 平，史艷紅

(1．遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州遵義 563099;2．河南省扶溝縣人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 扶溝461300)

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征是指在睡眠時(shí)由 于上氣道的狹窄或阻塞所引起的反復(fù)的呼吸暫?；虻屯?，睡眠呼吸暫停指數(shù)大于或等于5次/h，出現(xiàn)慢性間歇性低氧。OSAS是臨床常見病，而且具有潛在危險(xiǎn)性，可造成全身多系統(tǒng)、多器官功能的損害。Punjabi NM［1］對(duì)OSAS成人進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查顯示OSAS患病率3% ～7%，Young等［2］流行病學(xué)研究證實(shí)男女發(fā)病率之比約為2．4∶1，男女發(fā)病率分別高達(dá)9% ～15%和4% ～9%，患病率隨年齡遞增。20世紀(jì)80年代以來OSAS受到了廣泛的關(guān)注，臨床和基礎(chǔ)研究在全世界范圍內(nèi)取得了迅速發(fā)展，但其發(fā)生發(fā)展及引起相關(guān)并發(fā)癥的具體機(jī)制方面至今仍未徹底闡明。本實(shí)驗(yàn)擬通過于大鼠雙側(cè)舌腭弓、咽腭弓及舌根處注射透明質(zhì)酸鈉凝膠建立上呼吸道阻塞模擬阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征模型，同時(shí)觀察腦組織的損傷及腦血管病變情況，為本課題深入進(jìn)行OSAS與缺血性腦卒中的研究提供一個(gè)穩(wěn)定、可行的動(dòng)物模型。

1 材料

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠40只，重200～250g，雌雄分籠飼養(yǎng)，由中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物中心提供［許可證號(hào)SCXK(渝)2007－0005］。

1．2 實(shí)驗(yàn)試劑 醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠(上海其勝生物制劑公司，批號(hào)110552－01);戊巴比妥鈉(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)CAS#57－33－0)。

1．3 實(shí)驗(yàn)儀器 鼻鏡(廣東新星醫(yī)療器械廠);插件式多參數(shù)神經(jīng)監(jiān)護(hù)儀(NTS－3000 B，上海諾誠(chéng)醫(yī)療器械有限公司);電子顯微鏡(DM 4000B，德國(guó)Leica公司);Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)(德國(guó)Leica公司);石蠟切片機(jī)(RM－2235，德國(guó)Leica公司)。

2 方法

Wistar大鼠隨機(jī)抽簽法分為正常對(duì)照組(10只)、OSAS組(30只)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周開始造模。

2．1 阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征組模型 以2%的戊巴比妥鈉溶液50 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠后，取仰臥位，鼻鏡做開口器暴露口咽腔，于雙側(cè)舌腭弓、咽腭弓及舌根處注射透明質(zhì)酸鈉凝膠至大鼠出現(xiàn)呼吸暫停，將舌體牽拉于口外，防止其窒息死亡，直至大鼠完全清醒。①出現(xiàn)伴有胸腹反常運(yùn)動(dòng)的呼吸暫停，即為阻塞性呼吸暫停②監(jiān)測(cè)腦電、口鼻氣流、血氧飽和度:無菌針灸針作針電極，取大鼠雙目中上方約0.5 cm、兩側(cè)乳突分別作 FP1、FP2、A1、A2 腦電電極的位置(FP1、FP2代表記錄電極，A1、A2代表參考電極)，口鼻氣流熱敏傳感器貼于大鼠雙側(cè)前鼻孔監(jiān)測(cè)口鼻氣流，將鼠尾穿過血氧探頭監(jiān)測(cè)外周血氧飽和度。分別于注射透明質(zhì)酸鈉前1 wk、注射后4 wk，以2%的戊巴比妥鈉溶液25 mg/kg做腹腔內(nèi)注射造成淺麻醉狀態(tài)模擬自然睡眠狀態(tài)(即對(duì)強(qiáng)刺激有反應(yīng)，對(duì)淺刺激無反應(yīng))，監(jiān)測(cè)2 h，大鼠清醒時(shí)腦電波為高頻率，低幅度;睡眠時(shí)腦電波為低頻率，高幅度。人工計(jì)數(shù)2 h內(nèi)每只大鼠的呼吸暫停次數(shù)，計(jì)算呼吸暫停指數(shù)。

2．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材 13 wk后，以2%的戊巴比妥鈉溶液50 mg/kg作腹腔內(nèi)注射麻醉，斷頭取腦，取皮質(zhì)海馬置多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，切片固定于載玻片上，蘇木素/伊紅染色(hematoxylin and Eosin stain，HE stain)，顯微鏡下觀察大鼠皮質(zhì)及海馬區(qū)腦組織及腦血管。

2．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17．0軟件分析，計(jì)量資料正態(tài)性檢驗(yàn)后以x±s表示，采用 t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3．1 OSAS模型 OSAS大鼠模型建立后，觀察中發(fā)現(xiàn)睡眠打鼾、口唇稍發(fā)紺、呼吸暫停伴胸腹式反常呼吸運(yùn)動(dòng)，呼吸暫停后數(shù)秒伴血氧飽和度的減低。清醒期一般情況無異常。睡眠呼吸監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)大鼠口鼻氣流的呼吸波形消失，同時(shí)人工觀察見大鼠胸腹式反常呼吸運(yùn)動(dòng)，造模前后平均血氧飽和度(mean oxygen saturation，MSaO2)、最低血氧飽和度(lowest oxygen saturation，LSaO2)、呼吸暫停指數(shù)(apnea index，AI)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可判定為阻塞性呼吸暫停綜合征。造模及睡眠呼吸監(jiān)測(cè)見圖1A －1D。經(jīng)t檢驗(yàn)，OSAS大鼠 MSaO2、LSaO2較造模前降低，AI較造模前增高，比較有差異(P＜0.05)(見表1)。

表1 OSAS大鼠造模前后 MSaO2、LSaO2、AI比較

3．2 皮質(zhì)海馬HE染色 對(duì)照組:神經(jīng)元排列整齊緊密，層次分明，細(xì)胞數(shù)量較多，胞質(zhì)均質(zhì)紅染，核大而圓，核仁清晰。OSAS組:神經(jīng)元排列紊亂，細(xì)胞減少，部分胞漿空泡樣變，胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，核染色質(zhì)不均勻，核周間隙增大，核固縮深染，呈紫藍(lán)色梭形或三角形，腦小血管數(shù)量有所增加。(見圖2～圖3)。

4 討論

以往國(guó)內(nèi)外學(xué)者有采用低壓氧艙或常壓低氧艙，造成全身低氧動(dòng)物模型，雖然接近人類OSAS病理生理特點(diǎn)，但無法模擬呼吸暫停時(shí)的咽腔負(fù)壓情況;也有國(guó)外學(xué)者采用氣管切開造口并設(shè)置氣管內(nèi)活瓣，計(jì)算機(jī)自動(dòng)開關(guān)活瓣，但其阻塞部位在氣管而非上氣道。上氣道狹窄是OSAS發(fā)病機(jī)制中最重要的因素，軟腭后區(qū)氣道是呼吸暫停的始發(fā)部位和主要阻塞部位。故本實(shí)驗(yàn)借鑒柳忠祿等［3］的方法通過在Wistar大鼠口咽部和舌根處注射透明質(zhì)酸鈉凝膠人為造成上氣道狹窄，導(dǎo)致睡眠時(shí)的呼吸暫停，以模擬人類OSAS發(fā)病的解剖學(xué)機(jī)制。

為了減少對(duì)動(dòng)物的損傷，本實(shí)驗(yàn)未采用埋置電極的方法，試用針灸針作為針電極，但因?yàn)闇\麻醉情況下模擬睡眠，針刺時(shí)痛刺激使大鼠易覺醒并反抗，導(dǎo)致電極部分脫落，干擾大，并且因接觸面積較小導(dǎo)電性能略差，腦電圖的圖像不很穩(wěn)定。我們?cè)O(shè)想如果現(xiàn)在使用的盤狀電極可進(jìn)一步改進(jìn)縮小，用脫毛液脫去動(dòng)物毛發(fā)，將電極緊貼皮膚后膠布固定，像人類做動(dòng)態(tài)腦電圖檢查一樣描記腦電波形，對(duì)大鼠既無手術(shù)損傷，又能達(dá)到電極與皮膚的充分接觸。當(dāng)然這種改進(jìn)需監(jiān)護(hù)儀廠家的技術(shù)支持。

人類呼吸停止10 s判定為呼吸暫停。Carley等［4］采用大鼠呼吸停止≥2．5 s作為呼吸暫停的判斷標(biāo)準(zhǔn)。大鼠的呼吸頻率為66～114次/min，2．5秒的呼吸暫停發(fā)生了2次以上呼吸周期的缺失。由于實(shí)驗(yàn)設(shè)備限制，大鼠不能使用胸腹帶判斷胸腹式呼吸的存在與否，實(shí)驗(yàn)中監(jiān)測(cè)到有一定頻率及幅度的正弦波為大鼠的正常呼吸波，當(dāng)正弦波消失，變成一條直線時(shí)，即為呼吸停止，同時(shí)人工觀察見胸腹式反常呼吸運(yùn)動(dòng)，判斷為阻塞性呼吸暫停。當(dāng)呼吸恢復(fù)，首先出現(xiàn)幅度較大的正弦波，規(guī)律的呼吸波、直線波再現(xiàn)，如此反復(fù)。注射前動(dòng)物出現(xiàn)阻塞性呼吸暫停，可能與大鼠口腔深，舌體較大，舌體后墜，加之戊巴比妥鈉麻醉后咽腔肌肉松弛，軟組織塌陷有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)中觀察到OSAS大鼠睡眠打鼾(類似一種喉鳴音)、口唇稍發(fā)紺、呼吸暫停伴胸腹式反常呼吸運(yùn)動(dòng)，呼吸暫停后數(shù)秒伴血氧飽和度的減低。目前國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中關(guān)于大鼠的血氧檢測(cè)不多見，我們通過淺麻醉狀態(tài)下鼠尾靜脈末梢血氧監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)呼吸暫停確實(shí)伴有血氧減低，更進(jìn)一步闡明了OSAS模型的可行性，造模前后的平均血氧飽和度、最低血氧飽和度及呼吸暫停指數(shù)差異性顯著。說明通過咽腔注射透明質(zhì)酸鈉凝膠建立的OSAS模型成功。

有學(xué)者認(rèn)為間歇低氧類似于缺血/再灌注，可造成神經(jīng)元丟失，導(dǎo)致相應(yīng)的腦功能障礙。楊宇等［5］發(fā)現(xiàn)慢性間斷性缺氧大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，電鏡可見海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化，突觸小泡減少，膜結(jié)構(gòu)模糊不清，毛細(xì)血管內(nèi)皮腫脹，表明慢性間斷性缺氧可引起神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷。Tsukamoto K等［6］研究發(fā)現(xiàn)，呼吸暫停時(shí)增加缺氧誘導(dǎo)因子－1(hypoxia inducible factor－1，HIF－1)的轉(zhuǎn)錄活性，引起血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)，導(dǎo)致腦缺血后血管的再生。但VEGF過表達(dá)卻導(dǎo)致腦血管通透性增加，加重腦缺血缺氧，發(fā)生血管源性腦水腫［7］。Lavie等證實(shí)慢性低氧誘導(dǎo)腦小動(dòng)脈VEGF mRNA表達(dá)增強(qiáng)，VEGF合成增加，血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)，平滑肌細(xì)胞增殖，小動(dòng)脈壁增厚，管腔狹窄［8］。

鑒于大腦皮質(zhì)及海馬對(duì)缺氧比較敏感，是腦內(nèi)負(fù)責(zé)記憶、信息處理及信號(hào)傳遞的重要部位，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)觀察皮質(zhì)及海馬的結(jié)構(gòu)改變。研究中發(fā)現(xiàn)在OSAS大鼠大腦皮質(zhì)及海馬中，存在神經(jīng)元的減少，排列紊亂，細(xì)胞空泡樣變，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞壞死，伴小血管不同程度增生等表現(xiàn)，可能是OSAS前期腦功能減退、顱內(nèi)壓增高、腦動(dòng)脈硬化至腦血管閉塞的一個(gè)演變過程，為深入進(jìn)行OSAS與缺血性腦卒中的研究提供一個(gè)可行的動(dòng)物模型。本文采用HE染色只能對(duì)細(xì)胞形態(tài)作出初步評(píng)價(jià)，但壞死細(xì)胞個(gè)數(shù)、血管增生程度及數(shù)量改變尚不能明確，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可采用更先進(jìn)的手段，如共聚焦顯微鏡、PCR技術(shù)、免疫組化檢測(cè)等，對(duì)細(xì)胞功能狀態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)，進(jìn)一步完善對(duì)OSAS模型的研究。

［1］Punjabi N M．The epidemiology of adult obstructive sleep apnea［J］．Proc Am Thorac Soc，2008，5(2):136 －143．

［2］Young T，Peppard P E，Gottlieb DJ．Epidemiology of obstructive sleep apnea:a population health perspective［J］．Am J Respir Crit Care Med，2002，165(9):1217－1239．

［3］柳忠祿，王巖，李延忠．大鼠阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征動(dòng)物模型的建立［J］．山東大學(xué)耳鼻喉眼學(xué)報(bào)，2009，23(2):31－33．

［4］Carley D W，Trbovic S，Radulovacki M．Sleep apnea in normal and REM sleep－deprived normotensive Wistar－Kyoto and spontaneously hypertensive(SHR)rat［J］．Physiol Be hav，1996，59(4):827－831．

［5］楊宇，譚勝玉，張新民，等．慢性間歇性缺氧對(duì)認(rèn)知功能及海馬CA1區(qū)IGF－1表達(dá)的影響［J］．中國(guó)臨床心理學(xué)雜志，2007，15(1):85－87．

［6］Tsukamoto K，Kinoshita M，Kojima K，et al．Synergically increased expression of CD36，CLA －1 and CD86，but not of SR－A and LOX－1，with the progression to foam cells from macrophages ［J］．J Atheroscler Thromb，2002，9(1):57－64．

［7］Josko J，Kenfel K．The role of vascular endothelial growth factor in cerebral oedema formation［J］．Folia Neuropathol，2003，41(3):161 －166．

［8］Lavie L．Obstructive sleep apnoea syndrome－an oxidative stress disorder［J］．Sleep Med Rev，2003，7(1):35 －51．