劉旸，張海英，劉國紅，張宏偉,2，張霞,2,*

（1.天津出入境檢驗檢疫局，天津 300461；2.天津科技大學，天津 300457）

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）（L.mon）簡稱單增李斯特氏菌，是一種重要的人獸共患病病原體，感染人和多種動物，引起人和動物腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等癥狀。該菌也是一種最為常見的食源性病原菌，WHO將其列為20世紀90年代食品中四大致病菌之一。它在自然界中分布廣泛，4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，極易污染食品而引起食物中毒和李氏桿菌病的暴發(fā)，尤其是在歐美國家經(jīng)常發(fā)生[1-3]，給人類的健康及畜牧業(yè)的生產(chǎn)帶來嚴重的威脅，所以建立快速準確的檢測方法是保證食品衛(wèi)生安全和有效防治本病的重要手段。

目前對該菌的檢測主要有分離培養(yǎng)方法、免疫學方法[4]及PCR方法[5]等。分離培養(yǎng)法操作步驟繁瑣，檢測周期長，一般需要5 d～7 d完成，不能滿足快速檢測的要求[6]，免疫學方法具有操作簡單，檢測通量大的優(yōu)點，但是由于該菌與同屬異種菌具有交叉抗原，免疫學方法不能進行李斯特氏菌種間特異性鑒定[7]，而且檢測結(jié)果容易受多種因素影響，容易出現(xiàn)假陽性，不能滿足檢測的要求。PCR方法具有特異性強、靈敏度高等特點，但這類方法通常檢測成本高，需要比較昂貴的PCR儀，對實驗環(huán)境和操作者技術(shù)要求也比較高，常引起非特異性擴增，擴增反應時間較長,一般需要幾小時,不利于快速檢測和基層實驗室推廣應用。因此，發(fā)展新的快速準確、操作簡便、成本低廉的檢測與鑒定單增李斯特氏菌的方法對于提高食品衛(wèi)生水平、保證食品安全具有重要的意義。

1 材料

1.1 主要材料與試劑

dNTPs (Fermentas),10×Bst buffer(New England Biolabs),Bst DNA polymerase large fragment(New England Biolabs),MgSO4(Sigma),betaine(Sigma)，核酸快速檢測試紙條（杭州優(yōu)思達公司）。

菌株采用單增李斯特氏菌10株，包括2株標準菌株、食品中分離出的野生株8株及6株其他李斯特氏菌屬菌株，24株食源性致病菌詳見表1。

表1 試驗菌株Table 1 Bacterial strains for detection

1.2 主要儀器與設(shè)備

PCR擴增儀（Biometra）、離心機（Eppendorf，5417R）、DNA/RNA/蛋 白 分 析 儀（BHIMUZDA，Bio Specmini）。

2 方法

2.1 DNA的提取及定量

單增李斯特氏菌C53-3為試驗菌株，接種于10 mL營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)16 h，取1 mL用于細菌基因組提取，利用紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量及純度。

2.2 引物及探針的設(shè)計

利用單核細胞增生李斯特氏菌vir R基因序列（accession no.DQ449868.1）設(shè)計特異性引物及探針為：D1：5 －BIOTIN －GTCGGTCAATTGCAAAGAG；D2：5 －FITC-CTAGCCTGTGCCAAAGCA；D3：5-BIOTINTTATCATGCAAGTGCGAAC；CPR：5-GTCGGTCAATTG CAAAGAGACTTGATTAATATATAATTAGCCGTT；F：5-GTACACAGAAAAGCGCTG；R：5-TAGGCAAGTCATCT TGTTC。

組成兩套擴增體系，第一套擴增體系為CPR+F+R+D2+D1，第二套擴增體系為CPR+F+R+D2+D3。

2.3 反應體系和反應條件

反應體系為：10×ThermoPol buffer 2μL，10 mmol/L dNTP 0.8μL，100 mmol/L MgSO40.8μL，5 mol/L Betaine 2μL，8 U/μL Bst DNA pol 1μL，20μmol/L F/R 0.1μL/0.1μL，10μmol/L CPR 0.8μL，20μmol/L D1/D20.8μL/0.8μL，模板 1μL，ddH2O 補足至 50μL。

反應條件：61℃反應60 min。

2.4 結(jié)果檢測

將等溫PCR擴增產(chǎn)物滴加在核酸快速檢測試紙條上，15 min～30 min觀察，在質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)紅色線條，以檢測區(qū)是否出現(xiàn)紅色線條判斷反應結(jié)果陰陽性。

2.5 特異性試驗及引物篩選

對表1中菌株核酸樣本應用兩套引物探針體系進行試驗，以篩選一套合適引物及探針，同時證明該體系是否具有通用性及特異性。

2.6 靈敏度試驗

以C53-3為試驗菌株，接種于10 mL營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)16 h。（1）取1 mL用于細菌基因組提取，利用紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量及純度，進行DNA定量靈敏度檢測。（2）取1 mL做細菌計數(shù)，用PBS對菌液進行10倍梯度稀釋至10-8，取1 mL提取細菌基因組做實驗模板。

3 結(jié)果與分析

3.1 檢測體系的篩選及特異性實驗

對多株標準菌株、來自各國樣品中檢測出的陽性野生菌及其他相關(guān)陰性菌（見表1）核酸樣本進行試驗，進行引物的篩選及特異性實驗，以證明檢測方法是否具有通用性及特異性。

試驗結(jié)果表明兩套體系對于單增李斯特氏菌無論標準株或野生株檢測均為陽性，其他24株食源性致病菌檢測均為陰性，但是在針對李斯特菌屬其他菌種檢測時具有差別，第一套體系特異性良好，只在西爾李斯特菌檢測出現(xiàn)假陽性，而第二套體系特異性較差，在威爾李斯特氏菌及綿羊李斯特氏菌檢測均為假陽性。所以后續(xù)靈敏度試驗均采用第一套引物檢測體系。

3.2 靈敏度檢測

3.2.1 DNA檢測靈敏度

利用紫外分光光度計檢測C53-3 DNA純度為1.672，質(zhì)量34.08μg/mL。用TE對DNA原液進行10倍梯度稀釋至10-6，按照反應體系進行試驗，如圖1所示，當DNA稀釋10-1至10-4即濃度至3.4 pg/μL時檢測為陽性，在檢測區(qū)可見紅色條帶；稀釋至10-5至10-6更低稀釋濃度時，檢測結(jié)果為陰性，在檢測區(qū)無條帶顯示，說明該方法DNA檢測靈敏度可達到100pg/test。

圖1 單增李斯特氏菌DNA靈敏度試驗Fig.1 Sensitivity of detecting DNA of L.mon

3.2.2 純菌液靈敏度檢測

C53-3過夜菌液計數(shù)為5.4×108CFU/mL，用PBS對菌液進行10倍梯度稀釋至10-8即5.4×100CFU/mL，各取1 mL提取細菌基因組做實驗模板，檢測靈敏度結(jié)果見圖2，10-1至10-5稀釋時，結(jié)果為陽性，在檢測區(qū)可見紅色條帶；稀釋至10-6至10-8稀釋時檢測結(jié)果為陰性，在檢測區(qū)無條帶顯示，說明該方法菌液檢測靈敏度達到102CFU/test。

圖2 單增李斯特氏菌液靈敏度試驗Fig.2 Sensitivity of detecting L.mon in pure culture

4 結(jié)論

與傳統(tǒng)檢測手段相比，分子生物學檢測技術(shù)能更快，更可靠發(fā)現(xiàn)食品安全隱患，尤其是目前得到廣泛應用的等溫擴增方法將檢測提高到一個新的高度，很好地解決了目前基因檢測對儀器的依賴，使得分子生物學方法在基層及偏遠經(jīng)濟不發(fā)達地區(qū)得到廣泛使用。

本研究建立的單增李斯特氏菌恒溫擴增方法較環(huán)介導等溫擴增方法（LAMP）在檢測結(jié)果方面有了很好的改善。LAMP如果使用電泳來觀察，存在交叉污染的可能；如果采用肉眼觀察沉淀或顏色變化，那么陽性結(jié)果標準不能客觀地界定。本研究建立的方法結(jié)合核酸快速檢測試紙條進行檢測，依據(jù)試紙條上檢測線的有無可以明確判定陰陽性結(jié)果，其檢測DNA靈敏度可達到100pg/test、純菌液靈敏度達到102CFU/test可滿足樣品增菌后的檢測需求。雖然本方法在李斯特菌屬檢測中存在西爾李斯特氏菌檢測假陽性問題，但較免疫金標試紙條檢測只能檢測到李斯特氏菌屬的特異性上已經(jīng)有了很大程度的提高。結(jié)合實際樣品檢測結(jié)果表明，該方法靈敏度較高，無漏檢現(xiàn)象，操作簡便，不需要特殊設(shè)備，特別適合于基層實驗室檢測以及樣品的快速篩選檢測。

[1]MacDonald P D,Whitwam R E,Boggs J D,et al.Outbreak of Listeriosis among Mexican immigrants as a result of consumption of illicitly produced Mexican-style cheese[J].Clin Infect Dis,2005,40(5):677-682

[2]Gottlieb S L,Newbem E C,Grifin P M.Multistate outbreak of Listeriosis linked to turkey deli meat and subsequent changes in US regulatory policy[J].Clin Infect Dis,2006,42(1):2-36

[3]Mead P S,Dunne E F,Graves L.Nationwide outbreak of Listeriosis due to contaminated meat[J].Epidemiol Infect,2006,34(4):744-751

[4]Scheu P,Gasch A,Berghof K.Rapid detection of Listeria monoeytogenes by PCR-ELISA[J].Lett Appl Microbiol,1999,29(6):416-420

[5]Karpiskova R.Appilcation of a chromogenic medium and the PCR method for the rapid confirmation of L.monocytogenes in foodstuffs[J].J Mierobiol Methods,2000,41:267-271

[6]Nguyen L T,Gillespie B E,Nam H M,et al.Detection of Escherichia coli O157:H7 and Listeria monocytogenes in beef products by realtime polymerase chain reaction[J].Foodborne Pathog Dis,2004:1(4):231-240

[7]巢國祥,徐勤,周曉輝,等.單核細胞增生性李斯特菌PCR快速檢測方法建立及應用[J].中國人獸共患病雜志,2004,20(9):797-800

[8]Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res,2000,28(12):E63

[9]Mori Y,Kitao M,Tomita N,et al.Real-time turbidimetry of LAMP reaction for quantifying template DNA[J].Biochem Biophys Methods,2004,59:145-157