涂占晗 林 旭

福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，福建福州 350008

蛋白質(zhì)相互作用研究的常用方法進(jìn)展及比較

涂占晗 林 旭▲

福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，福建福州 350008

如今蛋白質(zhì)間的相互作用已成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)，而各種蛋白質(zhì)間相互作用的研究方法的飛速發(fā)展成為蛋白質(zhì)研究的重點(diǎn)。本綜述中將著眼于酵母雙雜交方法新進(jìn)發(fā)展與Sos系統(tǒng)、噬菌體展示、GST-pull down、免疫共沉淀、串聯(lián)親和純化等蛋白質(zhì)相互作用研究方法做一比較分析。以便在未來的研究中，根據(jù)不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)選擇合適的研究技術(shù)。

酵母雙雜交；Sos系統(tǒng)；噬菌體展示；GST pull-down；免疫共沉淀；串聯(lián)親和純化

蛋白質(zhì)作為生命活動的承載體已及功能的執(zhí)行者，了解蛋白質(zhì)的功能特性被視為理解生命活動的重要步驟。蛋白組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，使得發(fā)現(xiàn)新蛋白質(zhì)以及研究其功能和機(jī)制成為如今生命科學(xué)界的熱門課題。由于極大多數(shù)蛋白質(zhì)不能單獨(dú)行使其功能，而是通過與其他蛋白相結(jié)合形成復(fù)合體參與到細(xì)胞或機(jī)體的各種生理活動中。在對一種蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行研究的過程中發(fā)現(xiàn)，直接對感興趣蛋白進(jìn)行研究是非常困難的，通常利用蛋白與蛋白相互作用的特性，利用已知蛋白的功能對與其相互作用的未知蛋白的功能特性做出推斷及驗(yàn)證[1]。到目前為止，已涌現(xiàn)出多種蛋白與蛋白相互作用的檢測技術(shù)，但各自的適用情況和優(yōu)缺點(diǎn)各有不同。本文將著眼于酵母雙雜交方法新進(jìn)發(fā)展與Sos系統(tǒng)、噬菌體展示、GST-pull down、免疫共沉淀、串聯(lián)親和純化等蛋白質(zhì)相互作用研究方法做一比較分析進(jìn)行綜述。

1 酵母雙雜交系統(tǒng)及Sos恢復(fù)系統(tǒng)

1989年，在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的過程中，F(xiàn)ields和Song初步建立的酵母雙雜交系統(tǒng)[2]是近年來用于研究蛋白相互作用經(jīng)典有效的方法。酵母雙雜交系統(tǒng)是依據(jù)GAL4轉(zhuǎn)錄激活因子的特性進(jìn)行設(shè)計(jì)的。GAL4轉(zhuǎn)錄激活因子是一種由兩個彼此分離但功能必需的結(jié)構(gòu)域組合而成的，即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD），DNA-BD 能夠識別并結(jié)合位于GAL4反應(yīng)元件的上游激活序列（UAS），但必需與AD結(jié)合后才能激活UAS下游的啟動子，從而表達(dá)出GAL4完整的轉(zhuǎn)錄因子活性，使啟動子下游的報(bào)告基因 （如ADE2、HIS3、LacZ、MEL1）得到轉(zhuǎn)錄表達(dá)[3]。 見圖 1。

圖1 酵母雙雜交檢測蛋白質(zhì)相互作用機(jī)理

酵母雙雜交技術(shù)在蛋白質(zhì)相互作用的研究方面具有敏感、高效、簡捷、真實(shí)、廣泛等諸多優(yōu)點(diǎn)[4]，但它并非適用于所有蛋白質(zhì)。因其原理決定，酵母雙雜交只能檢測定位于胞核內(nèi)的蛋白，對發(fā)生在胞質(zhì)和胞膜的相互作用或誘餌蛋白自身具有轉(zhuǎn)錄活性時，則不能將與其相互作用的蛋白質(zhì)篩選出來[5]。

最近幾年，Sos恢復(fù)系統(tǒng)對經(jīng)典的酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行了彌補(bǔ)。Sos系統(tǒng)是應(yīng)用一種突變菌株-cdc25H進(jìn)行構(gòu)建的。該菌株是一種在基因1328位置上有一個氨基酸殘基點(diǎn)突變，即CDC25基因。這種菌株不依賴轉(zhuǎn)錄激活機(jī)制但是對溫度敏感。在酵母菌株中的CDC25基因是人Sos（hSos）基因的同源基因，該基因可編碼一個能夠結(jié)合并激活Ras的脒基核苷酸交換因子，從而可啟動Ras信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。該系統(tǒng)的特性是，在37℃的條件下生長的為CDC25基因不表達(dá)的cdc25突變體抑制菌株，但是25℃這個特定的溫度下卻允許突變菌株-cdc25H生長。經(jīng)證實(shí)，人Sos（hSos）蛋白能夠補(bǔ)充cdc25菌株這種缺陷，并且具有激活酵母中Ras信號通路的功能，通過與其相互作用的蛋白可將表達(dá)出的hSos蛋白固定于細(xì)胞膜上，使得cdc25H酵母菌能夠在37℃生長。在該系統(tǒng)中，通過將誘餌蛋白基因構(gòu)建到pSos載體上，而目的蛋白基因則構(gòu)建到pMyr載體上可分別形成hSos和誘餌蛋白的融合蛋白，十四烷基化信號序列和目的蛋白的融合蛋白。由于十四烷基化信號序列的作用，目的蛋白可被固定于細(xì)胞膜上。繼而hSos蛋白能與誘餌蛋白作用，被固定在細(xì)胞膜上并激活Ras信號傳導(dǎo)通路，最終在37℃cdc25H菌株可得以生長。見圖2。

圖2 Sos系統(tǒng)原理示意圖

遺憾的是，該系統(tǒng)具有高背景假陽性等局限性，而應(yīng)用GST-pull down和Co-IP實(shí)驗(yàn)方法對初篩結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步篩查驗(yàn)證即成研究的重要方法和關(guān)鍵性步驟。

2 噬菌體展示（PDT）

1985年 George P.Smith[6]在絲狀噬菌體（filamentous bacteriophage,fd）的外殼蛋白基因III中克隆入RI核酸內(nèi)切酶基因片段獲得的噬菌體粒子可以在外殼蛋白中融合表達(dá)的酶分子。在之后的驗(yàn)證中證實(shí)EcoR I內(nèi)切酶抗體可以有效中和外殼蛋白表達(dá)有這種酶分子的噬菌體,此結(jié)果說明該酶分子的構(gòu)象和活性與天然酶分子相同或極為相似。該實(shí)驗(yàn)的成功標(biāo)志著噬菌體展示技術(shù)的開始。該技術(shù)的基本原理是：噬菌體外殼蛋白與外源蛋白質(zhì)或多肽的基因表達(dá)產(chǎn)物融合，并可展示于噬菌體表面，從而使得展示于噬菌體表面的外源多肽有較獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性,通過篩選表達(dá)有特異性多肽或蛋白的噬菌體而得到大量富集，然后進(jìn)行DNA測序。該技術(shù)是將展示肽的表型與基因型通過絲狀噬菌體直接地聯(lián)系起來[7]，再利用其配體的特異性親和力，將有需要的蛋白質(zhì)或多肽篩選出來[8]。Scott JK等[9]于1990年運(yùn)用該技術(shù)構(gòu)建了隨機(jī)多肽文庫，此文庫包含特定長度的隨機(jī)段肽，理論上涵蓋了某一長度短肽的所有氨基酸的排列組合序列。因依靠特定的氨基酸或特異性的肽段，可使蛋白質(zhì)間相互識別和作用。據(jù)該原理所述，用受體蛋白對隨機(jī)肽庫進(jìn)行篩查，以獲得與之結(jié)合的短肽序列，由篩得的短肽序列便可得到與目的蛋白相互作用所依靠的氨基酸殘基序列[10]，即可進(jìn)一步研究蛋白間的分子識別和結(jié)合等等。

這一研究技術(shù)也證明了無需了解蛋白的詳盡結(jié)構(gòu)也能夠?qū)ζ湎嗷プ饔眠M(jìn)行檢測。迄今為止，已構(gòu)建成功的噬菌體表達(dá)載體f1、M13、T4等，成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的重要工具。2004年，通過噬菌體展示技術(shù)的運(yùn)用，Jespers L等[11]運(yùn)用熱變性的原理發(fā)展了一種方法選擇和鑒定抗凝集蛋白，從而防止或促進(jìn)蛋白的凝集反應(yīng)，且在診斷凝集蛋白引起的疾病方面有重大意義。

3 GST-pull-down

Smith DB和其研究團(tuán)隊(duì)[12]于1988年利用谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶 （GST）融合標(biāo)簽純化出GST融合蛋白，GST-pulldown開始成為一種熱門研究方法。GST-pull-down這一研究方法是將誘餌蛋白的編碼基因與GST標(biāo)簽整合后表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白經(jīng)純化后與有目的蛋白質(zhì)的溶液孵育。經(jīng)一定時間的孵育后即會形成GST-融合蛋白-目的蛋白復(fù)合物，并用谷胱甘肽-Sepharose將其沉淀下來。最后通過聚丙烯酞胺凝膠電泳（SDS—PAGE）方法鑒定獵物蛋白。GST-pull down主要有兩方面用途：（1）鑒定能與已知融合蛋白質(zhì)相互作用的未知蛋白質(zhì)；（2）驗(yàn)證兩已知蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。

該方法特異性較強(qiáng)，也較簡便，能減少一定的假陽性率，也不需要使用同位素等危險(xiǎn)物質(zhì)，在研究蛋白質(zhì)相互作用中應(yīng)用廣泛。但該方法不適用于大規(guī)模篩查相互作用的蛋白，除此之外，活性融合蛋白的量及避免內(nèi)源性誘餌蛋白干擾是該方法成功的關(guān)鍵。

4 免疫共沉淀（Co-IP）

免疫共沉淀是一種研究蛋白質(zhì)之間相互作用的特異性強(qiáng)的研究方法。該技術(shù)運(yùn)用特異性抗體與蛋白特異性結(jié)合的原理，通常是蛋白或其復(fù)合物與帶有標(biāo)簽蛋白的特異性抗體的融合蛋白相互結(jié)合，形成蛋白復(fù)合體。用試劑將蛋白質(zhì)復(fù)合體進(jìn)行溶解，再利用通過親和色譜柱對標(biāo)簽蛋白具有特異吸附作用的特性將蛋白復(fù)合體分離純化出來，最后運(yùn)用SDSPAGE、雙向電泳或質(zhì)譜等技術(shù)對分離所獲的蛋白進(jìn)行鑒定。

此方法同樣不適用于相互作用蛋白的大規(guī)模篩查，但其優(yōu)勢在于能用于確定在生理?xiàng)l件下在細(xì)胞或組織內(nèi)是否存在與目的蛋白能夠結(jié)合并作用的蛋白質(zhì)，亦可運(yùn)用該方法驗(yàn)證蛋白間的相互作用。見圖3。

圖3 免疫共沉淀原理圖

5 串聯(lián)親和純化（TAP）

Rigaut G等[13-14]在1999年一同提出了一套稱為串聯(lián)親和純化（TAP）的研究方法，用于分離復(fù)合蛋白，該技術(shù)兼?zhèn)淞嗣庖吖渤恋砗蜆?biāo)準(zhǔn)親和純化的優(yōu)點(diǎn)，成為鑒定和分離蛋白質(zhì)復(fù)合體新途徑[15]。該研究方法首先將TAP標(biāo)簽整合于該蛋白質(zhì)的一端，標(biāo)簽由一個鈣調(diào)蛋白結(jié)合多肽（CBP）與蛋白標(biāo)簽組成，并將TEV蛋白酶切位點(diǎn)插入二者之間，之后用帶有TAP標(biāo)簽的基因置換內(nèi)源的蛋白基因并表達(dá)，且可與特定蛋白進(jìn)行識別和結(jié)合裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，并將所獲總蛋白加入IgG親和柱。親和柱上的IgG可與TAP標(biāo)簽的ProA端特異性結(jié)合，之后用洗脫液洗脫大多數(shù)非特異性結(jié)合蛋白，依次在洗脫液（含TEV蛋白酶）洗脫和鈣離子的協(xié)助下，獲得高純度的目的蛋白復(fù)合體（見圖4）。經(jīng)上述步驟所得的蛋白質(zhì)復(fù)合體再進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離及質(zhì)譜分析，進(jìn)而可發(fā)現(xiàn)其中的新組分或新蛋白復(fù)合物。

圖4 重組標(biāo)簽融合蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖

此種研究方法不僅能保持復(fù)合物結(jié)構(gòu)的完整性，并且能夠得到純度較高的特異性。因該技術(shù)的靈敏性、可靠性和特異性都優(yōu)于傳統(tǒng)的酵母雙雜交技術(shù)，尤其適用于研究蛋白質(zhì)在生理?xiàng)l件下的相互作用。但是，該技術(shù)在對高等真核細(xì)胞進(jìn)行研究時卻因原位蛋白標(biāo)記難在真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，且易受內(nèi)源蛋白的干擾等因素而具局限性。Foler D及其科研團(tuán)隊(duì)[16]將RNAi技術(shù)與TAP方法結(jié)合（iTAP技術(shù)），內(nèi)源基因可通過此技術(shù)發(fā)生沉默，減少內(nèi)源性基因的競爭性干擾作用。

6 對未來蛋白與蛋白相互作用研究的展望

機(jī)體內(nèi)蛋白之間的結(jié)合和相互作用是機(jī)體生理活動的基礎(chǔ)。通過不同的蛋白質(zhì)研究技術(shù)可了解和闡明蛋白相互作用及新蛋白的發(fā)現(xiàn)和作用機(jī)制等重要問題。蛋白組學(xué)研究的興盛標(biāo)志著后基因組時代的到來，蛋白功能的研究成為重中之重。以近期國內(nèi)外該領(lǐng)域的趨勢,現(xiàn)階段蛋白質(zhì)研究的熱點(diǎn)已鎖定于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系的揭示及其網(wǎng)絡(luò)圖的建立。多樣化的蛋白質(zhì)相互作用的研究方法，給科研工作者提供了多種多樣的研究途徑，但不同的研究方法具有各自的適用范圍及優(yōu)劣性，研究者需要根據(jù)自己的研究對象及課題設(shè)計(jì)，選擇合適的一種或幾種研究方法。同時，隨著科研條件和材料科學(xué)地不斷突破，許多新的研究技術(shù)和方法在不斷推陳出新，不斷改進(jìn)，這對蛋白質(zhì)的功能研究及解釋蛋白質(zhì)在生命活動中的角色和機(jī)制，具有重大意義。蛋白組學(xué)的發(fā)展必將推動生命科學(xué)大步向前。

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The advance and comparison in common research methods for protein-protein interactions

TU Zhanhan LIN Xu
Preclinical Medicine of Fujian Medical University,Fuzhou 350008,China

Protein-protein interaction has become a significant subject in life science research.With the rapid development,there are various research approaches have created for studies of protein-protein interaction.This review will make comparisons between the yeast two-hybrid,Sos,co-immunoprecipitation,GST pull-down,phage display,tandem affinity purification which are all the methods for this research.After that,it will analyze their own application characteristics.Finally,this review will discuss how to choose a suitable approach in different protein-protein interaction research based on different aims and requirements.

Yeast two-hybrid;Sos；Phage display;GST pull-down;Co-immunoprecipitation;Tandem affinity purification

R34

A

1674-4721（2012）05（b）-0018-03

▲通訊作者

2012-02-29本文編輯：陳 ?。?/p>