彭瑤，張文謹，連增林，靳冉，李晉生，孟坤

子宮內膜癌是常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅女性健康。目前治療子宮內膜癌的方法主要有手術治療、放射治療、化學抗癌藥物及激素治療等[1]。中藥類抗癌藥物具有有效、低毒的優(yōu)勢，作為治療腫瘤的替代或輔助療法日益受到人們的關注。

阿可拉定（SNG-162）是從中藥淫羊藿中分離提取得到的單一有效成分淫羊藿黃素，以近期發(fā)現的新型雌激素受體亞型 ER-α36 為作用靶點，臨床適應證為乳腺癌、子宮內膜癌以及雌激素受體亞型ER-α36 陽性的相關腫瘤。本實驗主要觀察阿可拉定及與順鉑聯(lián)合用藥對子宮內膜癌細胞的抗腫瘤作用，研究其對 ER-α36 及ER-α66 表達的影響，探討其可能的作用機制，為子宮內膜癌患者的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物及試劑 阿可拉定由北京珅奧基醫(yī)藥科技有限公司提供，黃色粉末狀，用 DMSO 配制成濃度為4 mmol/L的儲存液，4 ℃ 避光保存，使用前用含 10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液稀釋到相應濃度，且預實驗結果表明：儲存液稀釋到相應濃度后，細胞培養(yǎng)液中 DMSO 所占比例小于1%，對細胞生長無影響（同無 DMSO 培養(yǎng)液相比較，P ＞0.05）。順鉑（DDP）購自中日友好醫(yī)院；胎牛血清（FBS）、DMEM（高糖）培養(yǎng)基粉末、噻唑藍（MTT）、胰蛋白酶（0.25%）為Gibco公司產品；二甲基亞砜（DMSO）為北京化工廠產品；TRIzol 為美國 Invitrogen公司產品；逆轉錄試劑盒為美國 Promega公司產品；PCR 引物、100 bp DNA ladder、Taq 酶、dNTPs、PCR 緩沖液、PCR 染料均在北京賽百勝基因技術有限公司合成和購置。

1.1.2 細胞株 人子宮內膜癌 HEC-1B 細胞購自中科院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.1.3 儀器 凝膠成像儀購自美國 Bio-Rad公司；EDC-810 基因擴增儀購自北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；HERA cell 150 恒溫 CO2培養(yǎng)箱購自美國 Thermo公司；倒置顯微鏡購自日本 Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人子宮內膜癌 HEC-1B 細胞用含 10% FBS的DMEM 培養(yǎng)液，在細胞孵育箱中 37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，每 2～3 天傳代 1 次。

1.2.2 MTT 法檢測細胞增殖狀況 選取對數生長期的HEC-1B 細胞，用 0.25%的胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，以 8×104個/ml的密度接種于96 孔板，每孔 100 μl，每個藥物濃度設 5個復孔；24 h 后吸出孔內培養(yǎng)液，加入 100 μl 含不同濃度 SNG-162的培養(yǎng)液，藥物濃度為1、5、10、20 μmol/L；另設空白對照孔，分別繼續(xù)培養(yǎng) 24、48、72 h。每孔加入 10 μl（5 mg/ml）MTT，置于37 ℃ 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后終止培養(yǎng)，小心吸出孔內培養(yǎng)液，每孔加入 100 μl DMSO，輕微振蕩，充分溶解結晶。選擇 492、630 nm 波長，酶標儀測定各孔的吸光度值（A），計算平均吸光度值A（A630－A492）及細胞生長抑制率。抑制率=1－A實驗組/A對照組。

1.2.3 RT-PCR 檢測 ER-α36、ER-α66 基因表達 HEC-1B 細胞接種在10 cm2培養(yǎng)皿中，接種密度為105個/ml，培養(yǎng)條件同上，24 h 后吸出皿內培養(yǎng)液，加含 SNG-162的培養(yǎng)基 2.5 μmol/L、DDP（2.5μg/ml）、SNG-162 聯(lián)合 DDP（2.5 μmol/L、2.5μg/ml），另設空白對照組，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h。用TRIzol 裂解細胞，按照 TRIzol 使用說明書提取總 RNA，紫外分光光度計測 A260和A280，計算A260/A280≥ 1.8 合格，計算總 RNA 濃度。按照逆轉錄反應試劑盒說明進行 cDNA 合成。PCR 引物序列為：ER-α36 上游引物：5' TGGTTTCCTCGTG TCTAA 3'，下游引物：5' CAAAGTTTGTGGGT AGCT 3'，產物長度為219 bp；ER-α66 上游引物：5′ TCTACAGGCCAAATTCAGATAATCGA 3′，下游引物：5′ CCCTCACAGGACCAGACTCCATA 3′，產物長度為166 bp；內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）上游引物：5' ACGGATTTGGTCGTATT GGG 3'，下游引物：5' TGATTTTGGAGGGATCTC GC 3'，產物長度為220 bp。擴增條件均為95 ℃ 變性 5 min；95 ℃ 變性 40 s，55 ℃ 退火 40 s，72 ℃延伸 50 s，共 39個循環(huán)；最后72 ℃ 延伸 10 min。使用 PCR 儀進行擴增，以 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 擴增產物，以凝膠成像系統(tǒng)拍照后用quantity one 軟件進行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 阿可拉定抑制腫瘤細胞增殖

以阿可拉定處理 HEC-1B 細胞 24 h 后，細胞出現形態(tài)學的改變，48、72 h 后出現胞質濃集、細胞膜破裂現象。其抑制作用隨藥物濃度和給藥時間的增加逐漸增強（圖 1）。根據各組抑制率及藥物濃度的對數，采用回歸方程計算出72 h 阿可拉定的IC50值為5.26 μmol/L。

圖1 不同濃度阿可拉定對 HEC-1B 細胞增殖的影響Figure1 The effect of SNG-162 on HEC-1B cell proliferation

2.2 阿可拉定抑制 ER-α36 基因表達

實驗結果表明：與空白對照組比較，SNG-162組、SNG-162 聯(lián)合 DDP組均可明顯降低 ER-α36的表達（P＜0.05）。其中，SNG-162 聯(lián)合 DDP組對該基因的影響最顯著（P＜0.01）；與空白對照組比較，SNG-162 聯(lián)合 DDP 給藥組能夠顯著抑制細胞中 ER-α66的表達（P＜0.01）。（表1，圖 2）

表1 各給藥組對 HEC-1B 細胞 ER-α36、ER-α66的表達影響灰度值（ ）Table1 The gray value of ER-α36, ER-α66 in different groups ( )

表1 各給藥組對 HEC-1B 細胞 ER-α36、ER-α66的表達影響灰度值（ ）Table1 The gray value of ER-α36, ER-α66 in different groups ( )

注：與對照組比較，*P＜0.05；**P＜0.01。Note: Compared with the control group, *P＜0.05, **P＜0.01.

組別 Groups 藥物濃度 Concentration ER-α36/GAPDH ER-α66/GAPDH對照組 Control group 0 0.63±0.08 0.72±0.00 SNG-162組 SNG-162 group 2.5 μmol/L 0.35±0.02* 0.69±0.06 DDP組 DDP group 2.5μg/ml 0.57±0.05 0.84±0.04 SNG-162 + DDP組 SNG-162 combined with DDP group 2.5 μmol/L + 2.5μg/ml 0.13±0.02** 0.28±0.02**

圖2 各給藥組對 HEC-1B 細胞 ER-α36、ER-α66 表達的影響Figure2 The PCR images of HEC-1B ER-α36, ER-α66 expression in different groups

3 討論

子宮內膜癌是婦科常見腫瘤之一，常分為雌激素依賴性和非雌激素依賴性兩種類型。其中雌激素依賴性子宮內膜癌的發(fā)生與雌激素過度刺激及雌激素受體表達程度有關[2]。

雌激素受體蛋白由 595個氨基酸組成，分子質量為66 kD，被稱為ER-α66。近年來，發(fā)現 ER-α尚有一個分子質量為35.7 kD的新亞型，被命名為ER-α36。兩者不同之處在于ER-α36 缺乏兩個轉錄激活功能區(qū) AF-1和AF-2，卻仍然保留著 DNA結合區(qū)和部分配基結合區(qū)[3]。ER-α66 為核受體，而ER-α36 為膜受體[4]，ER-α36 可激活膜介導的雌激素信號傳導途徑，在細胞的內外信息交流中發(fā)揮重要作用。

ER-α36 在細胞的生長與凋亡中發(fā)揮重要作用[5]，該受體參與了子宮內膜癌中睪酮誘導的細胞增殖信號通路的調節(jié)[6]；部分雌激素通過細胞內信號傳導途徑的快速作用來調節(jié)細胞核基因轉錄和蛋白合成[7]；通過膜受體 ER-α36的介導，激活了PKCδ/ERK 通路且增強了 D1/cdk4的表達，表明ER-α36 很可能具有促進子宮內膜癌細胞增殖的效應[8]。

阿可拉定是以 ER-α36 為靶點從中藥淫羊藿中分離提取得到的單一有效成分，能夠抑制ER-α36的表達及腫瘤細胞的增殖。順鉑為金屬鉑類絡合物，屬周期非特異性抗腫瘤藥。在細胞內低氯環(huán)境中迅速解離，以水合陽離子的形式與細胞內DNA結合形成鏈間、鏈內或蛋白質 DNA 交聯(lián)，從而破壞 DNA的結構和功能，但對 RNA和蛋白質的合成無抑制作用[9]。順鉑抗瘤譜廣，但對子宮內膜癌等雌激素受體相關癌癥無特異性靶點作用，且毒副作用強烈[10]。

本實驗結果表明，阿可拉定能夠顯著抑制子宮內膜癌細胞的增殖及ER-α36 基因的表達，與順鉑聯(lián)用能夠增強其作用效果。由此推測，阿可拉定抑制子宮內膜癌細胞的增殖可能與抑制細胞中新型雌激素受體 ER-α36的基因表達有關；阿可拉定能夠增強順鉑的抗腫瘤作用。

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