陳詩萍，買世娟，余杏娟，柯妙拉，夏建川，高秋

隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)和腫瘤免疫學的發(fā)展，生物治療已成為繼手術(shù)、化療、放療后的第 4 種腫瘤治療模式。當前腫瘤生物治療技術(shù)包括分子靶點藥物、單克隆抗體、細胞因子、細胞免疫治療和基因治療。肺癌的生物治療依次經(jīng)歷了細胞因子（如 IL-2）療法、腫瘤殺傷細胞[如自體細胞因子誘導殺傷細胞（cytokine-induced killer，CIK）]的過繼免疫治療、腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）療法和單克隆抗體療法，但效果均不理想。根據(jù)腫瘤細胞與免疫細胞之間的信號傳導及抗原呈遞過程方面的研究，無論何種生物治療方法，宿主體內(nèi)的抗原加工與呈遞是誘發(fā)宿主免疫系統(tǒng)抗腫瘤免疫的核心。迄今為止，樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是所發(fā)現(xiàn)的功能最強的抗原呈遞細胞（APC）。有關研究已表明肺癌組織及外周血中 DC的數(shù)目與肺癌的預后呈成正相關，可是大多數(shù)肺癌組織中有 DC的數(shù)量減少或功能缺陷，因此考慮體外培養(yǎng) DC 并用抗原刺激制備腫瘤疫苗，用于治療術(shù)后殘余病灶或微轉(zhuǎn)移的患者。但由于肺癌是實體瘤，抗原性較弱，DC 疫苗的療效還未肯定，所以有必要通過實驗觀察 DC 誘導的抗肺癌免疫作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 淋巴細胞分離液為天津美德太平洋科技有限公司產(chǎn)品；GT-T561 無血清培養(yǎng)基為日本 TaKaRa公司產(chǎn)品；GM-CSF、IL-4、IL-1、IL-2干粉為北京四環(huán)生物制藥有限公司產(chǎn)品；TNF-α、IFN-γ、CD3 購自廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司；用 GT-T561 無血清培養(yǎng)基配成溶液。

1.1.2 儀器 JEM-2100F 型透射電鏡為日本電子株式會社產(chǎn)品；CYTOMICS FC500 型流式細胞儀為美國貝克曼公司產(chǎn)品。

1.1.3 實驗動物 SPF 級 BALB/C 裸小鼠50只，雌雄兼用，鼠齡 4～6周，體重 16～18 g，由中山大學醫(yī)學院實驗動物中心繁殖傳代（合格證：粵檢證字 2002A009）。飼養(yǎng)條件：恒溫，空氣層流過濾。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肺癌移植瘤模型建立 肺癌手術(shù)標本剪切成 2 mm×2 mm×2 mm的組織塊，接種裸鼠雙側(cè)背部皮下，模型建成后以等量移植瘤組織接種裸鼠，篩選有腫瘤生長的裸鼠以腫瘤體積為主要參數(shù)按照隨機的原則分組予以處理。計算公式為腫瘤體積=π/6(a+b)3，其中 a 為腫瘤長徑，b 為腫瘤短徑。

1.2.2 病理分析 取裸鼠肺癌移植瘤組織做病理切片，HE 染色觀察確定腫瘤類型，并與患者手術(shù)標本的病理切片比較。

1.2.3 DC 培養(yǎng)及負載 取用于建立裸鼠移植瘤的肺癌標本的同一患者的外周血，以淋巴細胞分離液常規(guī)分離，所得的單個核細胞用 GT-T561 無血清培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細胞濃度為6×106個/ml，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng) 1 h。貼壁的細胞成分中加入含有 IL-4（30 ng/ml）、GM-CSF（50 ng/ml）和慶大霉素（80 IU/ml）的GT-T561 無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第 2、4、6 天補加含IL-4（30 ng/ml）和GM-CSF（50 ng/ml）的培養(yǎng)基。將同一患者手術(shù)切除的肺癌組織用反復凍融的方法制備腫瘤細胞裂解物，在培養(yǎng)第 8 天加到DC 細胞中，濃度為100 mg/L，4 h 后加入工作濃度為10 ng/ml的TNF-α，培養(yǎng) 24 h 以刺激 DC成熟。

1.2.4 CIK 細胞培養(yǎng)及誘導 上述未貼壁細胞中加入含慶大霉素（80 IU/ml）、IFN-γ（50000 IU）的GT-T561 無血清培養(yǎng)基中，第 2 天補加入細胞因子 IL-1、IL-2和CD3，使終濃度分別為50 ng/ml、50000 IU/ml和5μg/ml。培養(yǎng)第 5 天補加含 IL-2的GT-T561 無血清培養(yǎng)基，在培養(yǎng)第 9 天，以 DC 與CIK 細胞 1∶10的比例將腫瘤細胞裂解物負載的DC 加入 CIK 細胞中，繼續(xù)培養(yǎng)，所得的細胞為DC-CIK 細胞。

1.2.5 倒置顯微鏡及透射電鏡觀察 DC 細胞 每天應用倒置顯微鏡觀察 DC 及CIK 細胞生長情況。收集 DC，用 2% 多聚甲醛和22.5% 戊二醛混合液前固定，經(jīng) PBS 漂洗后，用 1% 鋨酸后固定，梯度乙醇脫水、滲透，LR White 樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察。

1.2.6 細胞表型分析 單個核細胞培養(yǎng)第 5 天及抗原刺激后收獲 DC，用 PBS 洗滌重懸后加入PE 或 FITC 標記的CD1a、HLA2DR、CD80、CD86、CD14 鼠抗人單抗，于培養(yǎng)第 5 天和第10 天即與DC 共孵育 24 h 后收獲 CIK 細胞，用PBS 洗滌重懸后加入 CY5-PE、PE 或 FITC 標記的CD3、CD4、CD8 及CD56 鼠抗人單克隆抗體，4 ℃ 孵育 30 min，用 PBS 洗滌 2 次，重新懸浮，流式細胞儀檢測。分析軟件為ELITE，樣本細胞數(shù)不少于5×105個。

1.2.7 荷瘤裸鼠處理及處理后觀察 按照隨機分組原則將裸鼠分為4組，分別為DC-CIK組、CIK組、DC組和NS組（生理鹽水對照組），每組9只。于裸鼠腫瘤同側(cè)腋窩皮下分別注射 DC-CIK細胞、未經(jīng)誘導的CIK 細胞和DC。注射劑量為1×106個/只，注射液體總量為0.1ml/只。對照組注射等量生理鹽水。每星期觀察腫瘤生長情況2 次，直至處理后約 1個月，處死裸鼠稱取腫瘤重量，計算抑瘤率。

抑瘤率=（對照組平均瘤重－治療組平均瘤重）/對照組平均瘤重×100%

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 動物模型的建立

成功建立肺癌移植瘤模型，肺癌手術(shù)標本和裸鼠移植瘤組織 HE 染色比較，兩者病理類型一致，但移植瘤的腫瘤惡性程度增加（圖 1）。

圖1 肺癌患者手術(shù)標本與裸鼠肺癌移植瘤的病理學比較（×200）（A：高分化乳頭狀肺癌標本；B：裸鼠移植瘤組織）Figure1 Pathological comparison between resected sample of lung cancer patient and implanted tumor in nude mice (×200)(A: Resected sample of lung cancer patient was diagnosed as well-differentiated palillary adenocarcinoma; B: Xenografted tumor in nude mice)

2.2 DC的形態(tài)及細胞表型結(jié)果

細胞培養(yǎng) 24 h 后可見有少數(shù)細胞懸浮；第3～4 天懸浮細胞較多，聚集成團，細胞體積增大，形態(tài)不規(guī)則，長條形多見，有突起；培養(yǎng)第 6～7 天時細胞體積增大明顯，呈多邊形，長的突起增多；于培養(yǎng)第 7 天及與腫瘤抗原共孵育 1 d 后透射電鏡觀察，可見 DC 有大量長短不一的突起由胞體伸出，細胞核呈腎形并偏于一側(cè)，常染色質(zhì)增多，胞漿內(nèi)富含線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，較少溶酶體。與腫瘤抗原共孵育后，可觀察到 DC 細胞體積增大，突起增多增長，包繞并吞噬腫瘤細胞裂解物的現(xiàn)象（圖 2）。

圖2 透視電鏡觀察 DC的超微結(jié)構(gòu)（A：DC 典型形態(tài)×2400；B：DC 捕獲抗原×6400）Figure2 Transmission electron microscopy of cultured DC[A: Typical appearance of DC (×2400); B: DC capturing antigen (×6400)]

培養(yǎng)第 5 天，HLA2DR、CD14 表達較高，CD80 表達量較低。抗原刺激后CD86 表達較高，CD80 及HLA2DR 表達增加，CD1a 也有表達，CD14 表達有所降低（表1）。說明加入腫瘤抗原刺激后細胞表型有變化，因此，經(jīng)腫瘤細胞裂解物負載的DC是成熟型。

表1 DC 細胞表型結(jié)果Table1 Surface phenotype of DC cells

2.3 CIK 細胞的形態(tài)及細胞表型結(jié)果

培養(yǎng)第 3 天，CIK 細胞數(shù)目增多，體積也增大；第 7 天可見有細胞集落形成；當 DC 與CIK細胞共孵育 24 h 后所得的細胞即為DC-CIK 細胞，可見 CIK 細胞圍繞在DC的胞體及突起周圍。培養(yǎng)第 7 天電鏡觀察細胞核較大，核漿比例大，細胞核中異染色質(zhì)較多，胞漿內(nèi)細胞器較少。培養(yǎng)第 5 天及與腫瘤細胞裂解物負載的DC 共孵育后檢測 CD3、CD4、CD8 及CD56 抗原表達率，加入抗原刺激前后CD3、CD4 變化不明顯，而CD8 表達升高，CD56 表達降低（表 2）。

表2 CIK 細胞表型分析Table2 Surface phenotype of CIK cells

2.4 DC 誘導的CIK 細胞對肺癌移植瘤的生長抑制

肺癌移植瘤在裸鼠體內(nèi)傳第 4 代時取等量移植瘤組織接種裸鼠，4組裸鼠腫瘤平均瘤重、瘤體積和腫瘤生長抑制率見表3。DC-CIK 細胞對腫瘤的生長有抑制作用，且較 CIK 細胞的抑制作用更強（P＜0.05）。

3 討論

本實驗采用外周血作為DC 來源，用 75 cm2培養(yǎng)瓶貼壁的培養(yǎng)方法，并且應用自體血漿作為DC 生長必需的營養(yǎng)來源。該法優(yōu)點是取材方便，制備過程簡單，避免了應用異種血清 FBS 對 DC的干擾。本實驗應用患者自身手術(shù)切除標本作為腫瘤抗原來源，比較了抗原負載前后的表面抗原表達情況，刺激前 CD80 表達率較低，刺激后HLA2DR、CD80 顯著升高，表明該法制備的DC 已經(jīng)成熟。成熟與未成熟 DC的功能不同，未成熟 DC 捕獲抗原的能力較強，但激發(fā) T 細胞免疫反應能力較差，成熟的DC 具有較強的抗原呈遞功能，能將抗原呈遞給腫瘤抗原特異性 T 細胞，產(chǎn)生特異性的抗腫瘤免疫應答。本實驗制備的腫瘤抗原可以刺激DC 成熟并且使數(shù)量擴增，培養(yǎng)前后比較擴增率為4～5 倍。另外，本實驗從外周血一次分離所得的單個核細胞中，以貼壁的單核細胞作為DC的前體細胞，同時未貼壁的淋巴細胞用來培養(yǎng) CIK 細胞，合理利用各種細胞成分，不致造成細胞浪費，減輕患者負擔。培養(yǎng)所得的CIK 細胞通過光鏡觀察發(fā)現(xiàn)細胞擴增明顯，采用流式細胞儀表型分析 CIK細胞與DC 共孵育前后抗原表達率的變化，CD3表達率升高、CD4 變化不明顯，而 CD8 表達則有所升高，CD16/56 表達率明顯下降，說明 DC-CIK主要是表型為CD3+、CD8+的T 細胞，與報道中 CIK 細胞主要是 NK和T 細胞的說法不同，可能與腫瘤相關抗原 (TAA)-DC能特異性誘導CD8+ 細胞有關。

表3 DC-CIK 對肺癌裸鼠移植瘤生長的抑制作用（ ）Table3 The antitumor effect of DC-CIK cells on xenografted tumor in nude mice ( )

表3 DC-CIK 對肺癌裸鼠移植瘤生長的抑制作用（ ）Table3 The antitumor effect of DC-CIK cells on xenografted tumor in nude mice ( )

實驗組Groups腫瘤平均體積（cm3）Average volume (cm3)腫瘤平均重量（g）Average weight (g)抑制率（%）Inhibition rate (%)P 值P value DC-CIK 0.3183±0.32 0.4700±0.38 70.3 0 CIK 0.9836±0.31 1.0522±0.25 33.5 0.053 DC 0.9871±0.38 1.3000±0.25 17.9 0.291 NS 1.7134±1.32 1.5833±0.99 – –

由于裸鼠體內(nèi) T 細胞免疫缺陷，選用裸鼠實驗對象消除了動物體內(nèi) T 細胞的干擾，另外實驗中以肺癌患者手術(shù)標本建立移植瘤模型，能夠更好地模擬患者體內(nèi)情況，而且病理分析也發(fā)現(xiàn)移植瘤與手術(shù)標本病理類型一致，但是病理分級升高，這與患者術(shù)后微小殘余病灶的復發(fā)或者轉(zhuǎn)移的情況相似。所以本實驗實際上是以裸鼠為媒介模擬患者體內(nèi)情況，觀察 DC-CIK的體內(nèi)抗腫瘤作用，做到觀察的個體化。用肺癌手術(shù)切除標本建立移植瘤模型的過程中，發(fā)現(xiàn)傳代后接種成瘤率約為75%，所以本實驗不能預先觀察 DC 對肺癌移植瘤發(fā)生的預防作用，只能觀察其對移植瘤的生長抑制作用。

實驗過程中發(fā)現(xiàn)，在處理后的第 15 天左右，DC-CIK組中腫瘤開始較快地生長，這說明了DC-CIK 對體積較小的腫瘤抑制作用明顯，而隨著腫瘤體積增大，這種抑制作用減小。因而臨床上 DC應當用于治療手術(shù)后微小殘余病灶和微轉(zhuǎn)移病灶，而且應當縮短注射的間期。本實驗通過荷瘤裸鼠體內(nèi)抗瘤實驗證實了 DC-CIK 細胞抗肺癌作用明顯高于CIK 細胞的作用，提示 DC-CIK 細胞治療是更為有效的抗肺癌生物治療方法，為DC 疫苗用于臨床治療提供了理論依據(jù)。

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