王艷芳，唐 玲，李榮英，李 戈

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥用植物研究所云南分所，云南景洪 666100)

滇重樓Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz是2010年版《中國(guó)藥典》收載的重樓藥材基原植物之一，是“云南白藥”、“宮血寧”等多種中成藥的主要原料［1］。滇重樓可以應(yīng)用根莖或種子進(jìn)行繁育，但由于滇重樓種子存在二次發(fā)育特性，種子繁殖一直未能在生產(chǎn)上應(yīng)用。研究表明［2～3］，滇重樓果實(shí)成熟時(shí)，里面種子的種胚生長(zhǎng)停留在球形期，種子從采集當(dāng)年的9～12月到第二年冬季之前完成形態(tài)成熟及各器官的發(fā)育，在此過程中，胚根最先突破種皮，當(dāng)胚根長(zhǎng)于1.5cm時(shí)可判斷種子完成胚根及胚芽發(fā)育，大田表現(xiàn)為種子只發(fā)根不出苗，發(fā)育完全的胚芽需經(jīng)過第二年冬季低溫打破胚軸的休眠到第三年春季才出苗，且出苗率很低。孟繁蘊(yùn)等［4～5］將滇重樓種子的二次發(fā)育歸屬為形態(tài)-生理后熟休眠類型，認(rèn)為溫度和萌發(fā)抑制物等都是影響其休眠的關(guān)鍵因素。本文以滇重樓種子發(fā)根率和胚根發(fā)育長(zhǎng)短為指標(biāo)，研究種皮、濕度、外源激素、種子成熟度等因素對(duì)滇重樓種子二次發(fā)育過程中種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)的影響，旨在為滇重樓種子種苗繁育提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為2010年9月末到11月末在云南境內(nèi)武定、鶴慶、鎮(zhèn)沅收集的3份新鮮滇重樓種子(表1)，各種源均經(jīng)過本研究通訊作者李戈鑒定。其中武定種子分去皮和帶皮保存，其他2份均去皮保存，各供試材料與濕沙 (濕沙以手握成團(tuán)落地即散為度)按重量1∶4～1∶6比例混合，置于20℃恒溫人工氣候箱里保存。

表1 各供試材料信息

1.2 方法

1.2.1 種皮處理及溫度實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)選取武定帶皮和去皮種子各6份，每份100～500粒不等，放入紗布袋，置于人工氣候箱，分20℃恒溫沙藏85d、20-10-20℃變溫沙藏115d(60d-30d-25d)統(tǒng)計(jì)總的發(fā)根率和各長(zhǎng)度胚根所占比例，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 赤霉素實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)選取武定去皮種子18份，每份100～500粒不等，分別設(shè)100×10-6和600×10-6赤霉素浸種24h處理，以不處理的為空白對(duì)照，然后將對(duì)照和經(jīng)赤霉素處理的種子置于人工氣候箱，分20℃恒溫沙藏85d、20-10-20℃變溫沙藏115d，統(tǒng)計(jì)總的發(fā)根率和各長(zhǎng)度胚根所占比例，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 沙藏濕度實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)選取武定去皮種子12份，每份30～60粒不等，使用營(yíng)養(yǎng)袋，以沙子為基質(zhì)，設(shè)置4個(gè)不同的沙藏濕度 (表2)，置于20℃恒溫人工氣候箱，每日稱重，補(bǔ)足失去的水分，85d后統(tǒng)計(jì)總的發(fā)根率和各長(zhǎng)度胚根所占比例，每個(gè)濕度梯度水平3個(gè)重復(fù)。

表2 沙藏濕度設(shè)計(jì)

1.2.4 不同種子來源

選擇野生種源的鶴慶、鎮(zhèn)沅去皮種子及栽培種源的武定去皮種子各3份，每份100～500粒不等，放入紗布袋，置于20℃恒溫人工氣候箱，一定時(shí)間后統(tǒng)計(jì)總的發(fā)根率和各長(zhǎng)度胚根所占比例。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)用胚根長(zhǎng)度和發(fā)根率來表示重樓種子胚根的萌發(fā)及生長(zhǎng)情況，各指標(biāo)計(jì)算方法:

發(fā)根率=規(guī)定沙藏日期內(nèi)發(fā)根種子粒數(shù)*100%/供試種子粒數(shù);

胚根長(zhǎng)度=規(guī)定沙藏日期內(nèi)胚根達(dá)一定長(zhǎng)度的種子*100%/供試種子粒數(shù);

數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行S-N-K方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種皮與溫度

種皮對(duì)重樓種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)的抑制作用很明顯 (表3)。在一定時(shí)間內(nèi)，無論是在20℃恒溫條件下，還是在20-10-20℃變溫情況下，去皮重樓種子的發(fā)根率都明顯高于帶皮種子，同時(shí)去皮重樓種子各長(zhǎng)度胚根比例均明顯高于帶皮種子。

重樓種子在20℃恒溫沙藏一定時(shí)間完成形態(tài)后熟后，胚根突破胚乳開始生長(zhǎng)，但放入10℃低溫環(huán)境下，胚根生長(zhǎng)受抑制，待放入20℃恒溫箱后胚根再次開始生長(zhǎng)，但胚根生長(zhǎng)情況不及一直恒溫沙藏85d的對(duì)照處理 (表3)。

表3 溫度及種皮對(duì)種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)的影響

2.2 赤霉素處理

表4 赤霉素對(duì)種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)的影響

赤霉素處理實(shí)驗(yàn)中 (表4)，20℃恒溫情況下，赤霉素處理對(duì)種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)情況影響不顯著(P＞0.05)，20-10-20℃變溫情況下，未經(jīng)赤霉素處理的對(duì)照種子受低溫影響，115d后發(fā)根率和各長(zhǎng)度胚根比例均較低，赤霉素處理的發(fā)根率和各長(zhǎng)度胚根比例均較高，與對(duì)照的存在顯著差異 (P＜0.05)，說明赤霉素處理可以打破低溫對(duì)種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)的抑制作用。

2.3 沙藏濕度

表5 沙藏濕度對(duì)種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)的影響

由于沙子的持水能力弱，在7%～27%的濕度范圍內(nèi)，包括了沙子的水勢(shì)范圍，本研究發(fā)現(xiàn)重樓種子在整個(gè)實(shí)驗(yàn)的沙藏濕度范圍內(nèi)種子均有萌發(fā)，方差分析表明，在13%濕度下重樓種子的發(fā)根率顯著高于7%濕度和27%濕度 (P＜0.05)，但各濕度之間胚根生長(zhǎng)長(zhǎng)度不存在顯著差異 (P＞0.05)，且發(fā)根率均高于65%(表5)，所以作者認(rèn)為重樓種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)受沙藏濕度影響不大。

2.4 不同種子來源

表6 種子來源對(duì)種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)的影響

武定種子為栽培種源，種子采收于果皮變黃開裂后，種皮較軟，去皮容易，沙藏85d后，發(fā)根率達(dá)77.45%，顯著高于其他兩個(gè)種源 (P＜0.05)，各長(zhǎng)度胚根比例也顯著高于其他兩個(gè)種源 (P＜0.05)。鎮(zhèn)沅種子和鶴慶種子均采自野外，采集時(shí)間較早，果皮青綠未開裂，種皮僵硬，去皮困難，沙藏115d后，鎮(zhèn)沅種子發(fā)根率為38.73%，胚根長(zhǎng)度比武定種子短很多，鶴慶種子幾乎全部腐爛，發(fā)根率為0(表6)。

3 討論

3.1 種皮對(duì)種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)的影響

種皮的作用首先是保護(hù)種子應(yīng)對(duì)外界不良環(huán)境，新鮮的重樓種皮是由具有葉肉和一定肉質(zhì)化程度的多漿疏水物質(zhì)構(gòu)成［4］，可以避免種子在野外干燥環(huán)境下過快失水干燥死亡，還有報(bào)道種子的種皮有抑制種子萌發(fā)的作用［6］。作者推測(cè)種皮的這種抑制作用可能是重樓種子長(zhǎng)期適宜自然環(huán)境的結(jié)果，如果沒有種皮的抑制作用，種子在土壤中可能提前萌發(fā)，遇到冬季低溫時(shí)胚根還沒有達(dá)到要求的長(zhǎng)度，胚芽也還未形成，造成種子無法破土出苗，從而對(duì)種子造成損傷。從此意義講，種皮的抑制作用可以保護(hù)種子安全過冬。至于種皮抑制種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的機(jī)制，有許多不同看法［4，6］，有人認(rèn)為是疏水的種皮含有抑制物質(zhì)，或阻止了種子內(nèi)部的萌發(fā)抑制物質(zhì)的溢出，具體到重樓種子種皮的抑制機(jī)理還需要進(jìn)一步的研究。

3.2 低溫對(duì)種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)的影響

重樓種子休眠和萌發(fā)是一個(gè)非常奇特的現(xiàn)象，同樣是低溫在重樓種子發(fā)育的不同時(shí)期作用是不同的，在重樓種子兩冬一夏的休眠史中，第二個(gè)冬天是打破重樓種子胚軸休眠的關(guān)鍵環(huán)境因素［5］，但第一個(gè)冬天卻可能是抑制重樓種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)的主要外界因素［2］，陳翠［7］等研究表明，重樓種子胚根的最適萌發(fā)溫度在18～20℃之間，高溫或低溫都會(huì)不同程度的抑制重樓種子萌發(fā)和胚根生長(zhǎng)，9℃時(shí)發(fā)根率為0。本實(shí)驗(yàn)觀察10℃低溫對(duì)重樓種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)低溫仍會(huì)抑制種子萌發(fā)和胚根的生長(zhǎng)，并且在低溫處理后還會(huì)影響重樓種子胚根在最適溫度下的萌發(fā)及生長(zhǎng)速度，這可能是溫度的突然轉(zhuǎn)換，種子內(nèi)部與萌發(fā)相關(guān)的激素等物質(zhì)相應(yīng)需要轉(zhuǎn)換造成的一個(gè)時(shí)間滯后，至于是否會(huì)對(duì)種子最后總的發(fā)根率造成影響，以及重樓種子胚根可以耐受的最低溫是多少，還需要進(jìn)一步研究。

3.3 赤霉素對(duì)種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)的影響

袁理春等［2］研究結(jié)果表明，在適溫條件下，由于重樓種子內(nèi)部各種激素水平平衡，外源赤霉素對(duì)重樓種子的二次發(fā)育沒有明顯促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)在常溫下研究結(jié)果與袁理春相似，同時(shí)發(fā)現(xiàn)赤霉素可以打破低溫對(duì)滇重樓種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)的抑制作用。根據(jù)孟繁蘊(yùn)［5］的研究，低溫會(huì)使重樓種子內(nèi)赤霉素的含量下降，而本研究中外源赤霉素的加入，補(bǔ)充了低溫造成的赤霉素的不足，使重樓種子在低溫下可以正常萌發(fā)。

3.4 種子來源對(duì)種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)的影響

本實(shí)驗(yàn)中，野生種源重樓種子和栽培種源重樓種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)情況差異明顯，經(jīng)分析作者認(rèn)為不同來源種子由于其本身的遺傳差異和生長(zhǎng)壞境的影響可能造成其種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)不同，但在本實(shí)驗(yàn)中作者認(rèn)為各來源種子成熟度不同可能是導(dǎo)致種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)差異的主要因素。實(shí)驗(yàn)中三分不同來源種子中，鎮(zhèn)沅和鶴慶種源屬于野生重樓種子，在野外屬于隨見隨采的情況，成熟度很難保證，而家種的武定重樓種子可以等到完全成熟再采集，保證了種子的成熟度。所以作者建議，在生產(chǎn)中，要盡量選擇在正常生長(zhǎng)期，成熟度好的栽培重樓種子作為種源進(jìn)行種苗繁育，這樣才可以確保種子的正常萌發(fā)，提高種子的萌發(fā)速度和萌發(fā)率。

另外，重樓種子胚根萌發(fā)和生長(zhǎng)對(duì)土壤濕度的適應(yīng)范圍很大，說明濕度可能不是引起重樓種子休眠的關(guān)鍵因素。

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