崔 瑾 王耀獻 孫衛(wèi)衛(wèi) 劉尚建 沈 存 呂 杰 王曉楠

（北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東直門醫(yī)院，北京 100700）

腎間質(zhì)纖維化是多種慢性腎臟病進行性發(fā)展的最終結(jié)果，它以過量細胞外基質(zhì)在腎間質(zhì)積聚及腎間質(zhì)成纖維細胞增生為特征。研究表明蛋白激酶（PKC）同工酶位于腎間質(zhì)纖維化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上游，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的產(chǎn)物在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展過程中起十分重要的作用，因此調(diào)節(jié)PKC同工酶活性就可以在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)啟動階段防治腎間質(zhì)纖維化［1-2］。和解聚散方是王耀獻教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗總結(jié)得出，能夠改善腎功能，延緩終末期腎臟病進程［3-5］。基于以上理論及前期研究結(jié)果，本文擬重點探討和解聚散方抗腎纖維化的作用機制是否與抑制大鼠腎組織PKC的表達有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 清潔級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量180～220g，購自維通利華實驗動物公司。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機分為假手術(shù)組、模型組、洛丁新組、和解聚散方組，各10只，供給清潔大鼠飼料，自由飲水、進食，每籠5只，保持籠內(nèi)清潔。

1.2 藥物與試劑 和解聚散方由黃芪、當歸、海藻、牡蠣、穿山甲等藥物組成，來源于東直門醫(yī)院中藥房，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院制成煎劑，濃縮后高溫消毒封裝備用，質(zhì)量濃度為每毫升含生藥1g。鹽酸苯那普利（洛丁新）購自北京諾華制藥有限公司。兔抗鼠PKC（武漢博士德生物工程有限公司），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），兩步法免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）

1.3 造模及給藥 采用右側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù)制備單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）模型，模型組、洛丁新組、和解聚散方組以5%水合氯醛腹腔注射將大鼠麻醉后局部剃毛，常規(guī)消毒鋪孔巾，選擇背部正中線肋脊角旁開1cm切口，依次切開皮膚至腹腔，游離腎臟及輸尿管，將右側(cè)輸尿管結(jié)扎，然后連續(xù)縫合皮膚。假手術(shù)組手術(shù)入路方式同模型組，進入腹腔后分離右輸尿管但不結(jié)扎輸尿管。造模術(shù)后24h開始分別灌胃，假手術(shù)組、模型組灌胃生理鹽水（3mL/只），洛丁新組灌胃洛丁新［1.0mg/（kg·d）］，和解聚散方組灌胃和解聚散方［9.8g/（kg·d）］。于造模術(shù)后第7日處死大鼠，留取梗阻側(cè)腎組織備用。

1.4 標本采集與檢測 （1）腎組織病理檢查：取梗阻側(cè)腎組織，以4%多聚甲醛固定后，脫水、浸蠟、石蠟包埋，切成3μm厚度的切片，分別行HE染色及Masson染色，光鏡下觀察腎臟皮質(zhì)區(qū)及皮髓交界區(qū)腎小管、腎間質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化。（2）免疫組化檢測：使用兩步法免疫組化試劑盒，操作步驟按試劑盒說明進行，PBS代替一抗作為陰性對照，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，采用光學(xué)顯微鏡（400×）觀察皮質(zhì)腎小管間質(zhì)區(qū)PKC-βⅡ的表達，以光鏡下細胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性信號。半定量分析采用Image Proplus 6.0多媒體彩色病理圖像分析軟件。光鏡下在皮質(zhì)區(qū)選取10個不重疊視野，盡量避開腎小球和血管，計算陽性表達面積占總面積的百分比。

2 結(jié) 果

2.1 病理學(xué)改變 HE、Masson染色觀察：假手術(shù)組腎間質(zhì)無纖維化；模型組出現(xiàn)腎間質(zhì)炎細胞浸潤，間質(zhì)水腫，且伴有不同程度的腎小管上皮細胞腫脹、空泡變性及腎小管灶狀萎縮，小管管腔閉塞和（或）擴張，部分腎小管腔內(nèi)有蛋白或細胞管型，間質(zhì)纖維化；洛丁新組、和解聚散方組病理變化較模型組減輕。

2.2 免疫組織化學(xué)和半定量分析 見表1。假手術(shù)組中PKC-βⅡ只在腎小管間質(zhì)細胞胞漿有少量表達；模型組、洛丁新組、和解聚散方組可見大量陽性表達出現(xiàn)在腎小管間質(zhì)細胞膜，同時部分小管上皮細胞胞漿內(nèi)也出現(xiàn)陽性染色顆粒。半定量分析顯示模型組中PKC-βⅡ在術(shù)后7d明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），兩個治療組的表達水平明顯低于模型組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠腎小管間質(zhì)PKC-βⅡ表達比較（）

表1 各組大鼠腎小管間質(zhì)PKC-βⅡ表達比較（）

與模型組比較，*P＜0.05；與洛丁新組比較，△P＜0.05。

組別 n PKC-βⅡ陽性表達面積（%）假手術(shù)組 10 2.1130±0.66269*模型組 10 8.8348±2.97066△洛丁新組 10 4.3774±1.23522*和解聚散方組 10 4.2757±0.60625*

3 討 論

UUO模型是目前公認的較為成熟的一種研究腎小管間質(zhì)纖維化的實驗動物模型。輸尿管結(jié)扎導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化，在本實驗中亦得到證實。

PKC屬于絲氨酸、蘇氨酸（Ser/Thr）激酶家族中的一員，它不是單一分子的酶，而是一組密切相關(guān)的有多種亞型的蛋白質(zhì)超家族。迄今為止，PKC至少有12種異構(gòu)體，經(jīng)典PKC包括PKC-α、βⅠ、βⅡ和γ。有研究顯示，PKCβⅡ表達于上皮細胞，可調(diào)節(jié)NF-κB的活性，從而參與炎癥纖維化。靜息狀態(tài)下PKC主要以無活性的形式存在于細胞質(zhì)內(nèi)，受到外界刺激時受其特異性底物蛋白吸引自胞質(zhì)向胞膜轉(zhuǎn)移，通過多種膜蛋白的磷酸化作用使構(gòu)象改變，假底物與催化區(qū)解離，導(dǎo)致PKC激活［6］。始動因子PKC的膜轉(zhuǎn)移現(xiàn)象為PKC激活的重要標志。腎組織PKC表達增高，將介導(dǎo)細胞增殖和分化，調(diào)節(jié)多種基因表達，如TGF-β，NF-κB等，促進腎間質(zhì)纖維化形成。因此，抑制PKC的表達有利于防治腎纖維化。

腎纖維化的中醫(yī)病機是“腎絡(luò)微型癥瘕”形成，消癥散結(jié)在腎纖維化的治療中具有重要意義。王耀獻教授創(chuàng)立和解聚散方，并以此加減治療慢性腎臟病，在臨床中取得了較好療效。和解聚散方由黃芪、當歸、海藻、牡蠣、穿山甲等藥物組成，方中以黃芪、當歸為君，補血活血，補氣扶正；穿山甲、海藻、牡蠣為臣，消癥散結(jié)，諸藥共奏和解聚散，扶正通絡(luò)之功。全方虛實并調(diào)，標本兼顧，為治療腎纖維化的有效方劑。藥理研究亦證實，黃芪能清除氧自由基，通過抑制TGF-β產(chǎn)生，減少ECM生成，調(diào)節(jié)細胞免疫及體液免疫，降低尿蛋白，保護腎功能［7］。

本實驗結(jié)果表明：和解聚散方能夠降低UUO大鼠腎組織中PKC的產(chǎn)生，減緩腎纖維化的發(fā)展。充分說明了和解聚散方具有良好的抗腎纖維化作用，抑制腎組織PKC的表達是其抗腎纖維化的機制之一，也說明了本方是一種防治延緩慢性腎臟病進展的有效中成藥物，有必要進行深入研究和臨床推廣應(yīng)用。

［1］Sanchez LE，Rodriguez VJ，Cartier C，et al.Inhibitory effect of interleukin-1 beta on angiotensinⅡ-induced connective tissue growth factor and typeⅣ collagen production in cultured mesangial cells［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2008，294（1）：F149-F160.

［2］Fields AP，Regala RP.Protein kinase Ciota：humanoncogene，Prognostic marker and therapeutic target［J］.Pharmacol Res，2007，55（6）：487-497.

［3］王耀獻，劉尚健，孫魯英，等.腎炎防衰治療慢性腎小球腎炎60例臨床觀察［J］.中國中藥雜志，2005，30（7）：555-556.

［4］王耀獻，劉尚健，趙宗江，等.腎炎防衰液對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠的治療作用［J］.中國中藥雜志，2005，30（10）：796-797.

［5］王耀獻，劉尚健，趙宗江，等.腎炎防衰液對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟保護作用［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2005，23（3）：458-461.

［6］Dris I，Gray S，Donnelly R.Protein kinase C activation：isozyme specific effects on metabolism and cardiovascular complications in diabetes［J］.Diabetologia，2001，44（6）：659-673.

［7］張翥，方敬愛，葉任高.中藥的腎保護與腎毒性［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2001，2（9）：552-553.