王翼洲 楊 輝 楊桂芳 柳 雯

（安徽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031）

本實驗組自擬經(jīng)驗方熱瘀散治療潰瘍性結腸炎（UC）取得肯定療效，尤其適用于輕、中度UC，效果顯著。但鑒于本病病因病機至今尚不十分清楚，故通過建立UC胃腸濕熱型大鼠模型，利用熱瘀散高、低劑量組進行治療，并設立相關對照組，選擇以上血清學細胞因子進行檢測后比較，以探討熱瘀散治療該病的作用機制，并探討UC的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 藥物 熱瘀散組成為：黃芪15g，白術12g，茯苓 12g，黃芩15g，黃連 9g，敗醬草 30g，丹參 15g，三七粉 3g，赤芍 15g，木香9g，白芍12g，炙甘草6g；由廣東一方制藥有限公司生產的顆粒劑組方，由安徽省中醫(yī)院藥劑科提供。

1.2 動物 wistar大鼠，體質量150～180g，雄性，由安徽醫(yī)科大學動物中心提供（合格證號：XK蘇2002-0025）。

1.3 試劑與儀器 2，4，6-三硝基苯磺酸 （TNBS，Sigma公司產品）的30%（體積分數(shù)）乙醇溶液，20%氨基甲酸乙酯。NO試劑盒為北京邦定生物公司產品。超氧化物歧化酶（SOD）放射免疫分析試劑盒，由北京北方生物技術研究所提供。白細胞介素（IL）-6放射免疫試劑盒，由北京北方生物技術研究所提供。丙二醛（MDA）測定試劑盒：南京聚力生物醫(yī)學工程研究所提供。高速組織勻漿儀（德國JANKE&KUNKEL GMBH公司）。GL-20A型高速冷凍離心機（湖南儀器儀表總廠離心機廠）。UV-260型可見紫外分光光度計（日本島津公司）。光學顯微鏡（日本Olympus AHBT-5B）。LRH-800-GS人工氣候箱為廣東省醫(yī)療器械廠產品。YC-DZOZ亞都超聲加濕器為北京亞都科技股份有限公司產品。電光分析天平，由上海天平儀器廠提供。純LBYN5A型旋轉式血流變儀（北京普利生儀器有限公司）。

1.4 分組與造模 將大鼠隨機分成正常對照組、模型對照組、熱瘀散高劑量組、熱瘀散低劑量組、柳氮磺胺吡啶（SASP）組。除正常對照組外，其余各組參照文獻［1-2］的方法建立UC胃腸濕熱型大鼠模型。將禁食12h動物，20%氨基甲酸乙酯腹腔注射麻醉，6mL/kg，將一直徑2.0mm長約12cm的橡膠輸液管，由肛門輕緩插入深約8cm，按100mg/kg質量濃度的三硝基苯磺酸（TNBS）推入結腸，每只0.5mL，讓動物保持平躺自然清醒。麻醉大鼠自然清醒后，將大鼠飼以高脂高糖飲食，即在普通飼料喂養(yǎng)的基礎上，加用200g/L蜂蜜水自由飲用，且隔日按大鼠體質量灌服油脂10g/kg，并與油脂隔日灌服10mL/kg白酒，共10d，然后放入溫度（32±2）℃，相對濕度為95%的人工氣候箱中，共5d。

1.5 給藥方法 完成造模后，熱瘀散高劑量組予8g/kg灌胃，熱瘀散低劑量組予2g/kg灌胃，SASP組經(jīng)口灌胃給予SASP 66.7mg/（kg·d）（按人常用劑量的5倍量換算），各組灌胃給藥均每日1次，連用15d；同時，模型對照組及正常對照組作常規(guī)飼養(yǎng)料理。

1.6 標本采集與檢測 留取標本進行血清學相關細胞因子檢測。包括 NO、IL-6、SOD、MDA、IL-8、IL-10、IL-13、腫瘤壞死因子（TNF）-α指標測定，測定方法按測定試劑盒說明書的方法進行。大鼠行腹主動脈取血，離心10min取血清待測。（1）SOD測定：采用微量快速測定法，取肝素抗凝血100μL加入盛有5mL生理鹽水的刻度離心機中，2000r/min離心10min，棄盡上清液，加預冷雙蒸水0.2mL、95%乙醇0.1mL、三氯甲烷0.1mL，振搖片刻，3000r/min離心10min，取上清液，再按試劑盒要求測定。（2）MDA測定：含量采用TBA比色法測定。利用MDA與硫代巴比妥（TBA）縮合，形成紅色產物，在532nm處有最大吸收峰，以四乙氧基丙烷為MDA標準品，取0.1mL血清，在與標準曲線相同的條件下反應，用比色法測定各管吸收光值。按公式計算MDA的含量。MDA （μmoL/g）=（測定管吸光度-測定空白管吸光度）/（標準管吸光度-標準空白管吸光度）×標準品濃度×樣本測試前稀釋倍數(shù)。（3）NO測定：南京建成生物工程有限公司試劑盒，采用酶標法高密度測定（ELISA）。設置測定管與標準管。測定管樣品 0.1mL，試劑 10.1mL，試劑 20.1mL，輕輕混勻，37℃水浴 1h，另加試劑30.5mL，試劑40.5mL混勻，室溫放置10min后，530nm波長處測定OD值，計算NO含量。IL-6的測定：采用雙抗體夾心ELISA法測定，具體按IL-6試劑盒說明書操作。（4）IL-8、IL-10測定：采用雙抗體夾心ABC-ELISA法，具體按試劑盒說明書操作。（5）TNF-α、IL-13 測定：采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），具體按試劑盒說明書操作。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，連續(xù)型變量用（）表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 熱瘀散對血清MDA、SOD、IL-6、NO的影響 見表1。與正常對照組比較，模型對照組SOD含量均顯著減少，MDA、IL-6、NO含量明顯增多 （P＜0.01）；SASP組及熱瘀散各組均能升高SOD含量，降低MDA、IL-6、NO含量，尤以熱瘀散高劑量組效果明顯，與SASP組比較有顯著差異（P＜0.01）；SASP組及熱瘀散低劑量組，與模型對照組比較有顯著差異（P＜0.01）；熱瘀散低劑量組與SASP組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組血清 MDA、SOD、IL-6、NO 水平比較（）

表1 各組血清 MDA、SOD、IL-6、NO 水平比較（）

與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.01；與SASP對照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。下同。

組別 n MDA（μmoL/g） SOD（U/mg） IL-6（pg/mL） NO （μmoL/g）正常對照組 10 23.44±1.9 785.11±15.56 52.28±9.57 196.43±3.95模型對照組 10 47.72±5.17* 53.23±11.78* 86.36±10.26* 382.13±9.93*熱瘀散高劑量組 10 26.92±2.94△▲▲ 76.23±11.78△▲▲ 49.97±8.67△▲▲ 264.07±9.84△▲▲熱瘀散低劑量組 10 33.03±2.57△ 61.78±12.33△ 69.34±9.37△ 303.61±3.71△SASP 組 10 34.91±2.97△ 60.16±13.16△ 70.22±9.93△ 315.11±29.12△

2.2 熱瘀散對血清IL-8、IL-10的影響 見表2。與正常對照組比較，模型對照組IL-8表達顯著增高，IL-10表達顯著降低（P＜0.01）；與模型對照組比較，各治療組IL-8顯著降低，各治療組IL-10表達均有不同程度回升 （P＜0.01）；熱瘀散高劑量組與SASP組比較，雖然高劑量組IL-8表達略低于SASP組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；熱瘀散高劑量組較SASP組IL-10表達增高（P＜0.05）；熱瘀散低劑量組與SASP組相比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 各組血清 IL-8、IL-10 含量比較（pg/mL，）

表2 各組血清 IL-8、IL-10 含量比較（pg/mL，）

組 別 n IL-8 IL-10正常對照組 10 34.847±3.985 111.111±5.369模型對照組 7 58.798±3.048* 69.203±6.374*熱瘀散高劑量組 9 41.074±3.009△ 96.663±3.431△▲熱瘀散低劑量組 8 49.692±3.183△ 85.701±3.572△SASP 組 8 41.694±3.261△ 89.587±5.202△

2.3 熱瘀散對血清TNF-α、IL-13的影響 見表3。與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清TNF-α表達水平顯著增高，IL-13表達水平顯著降低（P＜0.01）；與模型對照組相比較，各治療組大鼠血清TNF-α水平顯著降低，IL-13表達水平顯著升高 （P＜0.01）；熱瘀散高劑量組與SASP組比較，雖然高劑量組TNF-α表達略低于SASP組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；熱瘀散高劑量組較SASP組IL-13表達水平顯著增高（P＜0.05）；熱瘀散低劑量組與SASP組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 各組TNF-α、IL-13 水平比較（pg/mL，）

表3 各組TNF-α、IL-13 水平比較（pg/mL，）

組 別 n TNF-α IL-13正常對照組 10 49.27±1.98 126.39±3.95模型對照組 7 75.62±3.12* 78.98±4.92*熱瘀散高劑量組 8 58.63±1.06△ 105.67±4.16△▲熱瘀散低劑量組 8 67.82±3.18△ 94.26±3.82△SASP對照組 8 59.05±2.15△ 97.15±2.91△

3 討 論

筆者認為，UC的病機主要是脾虛為本，濕熱為因，血瘀是UC的重要環(huán)節(jié)，故以益氣健脾，清熱利濕，活血化瘀為治療大法。熱瘀散方中黃芩、黃連清熱燥濕、瀉火解毒，兩藥相須為君；黃芪益氣健脾利濕，白術補氣健脾、燥濕利水，與黃芪配伍以加強益氣健脾之功效，赤芍、丹參、敗醬草清熱化瘀止痛，木香行氣止痛，茯苓利水滲濕，共為臣藥；佐以白芍調和肝脾、緩急止痛，尚有斂陰和營之效，防清熱利濕太過，三七粉活血化瘀止痛，亦為佐藥；甘草炙用以益氣補中、緩急止痛，并能調和諸藥，是兼佐使之用。諸藥合用共達益氣健脾，清熱利濕，活血化瘀之功。

本實驗結果表明，熱瘀散能顯著提高胃腸濕熱型大鼠模型SOD活性，同時降低MDA含量，對UC有明顯的治療作用，其作用機制可能是SOD能有效地清除氧自由基從而抑制腸組織中的脂質過氧化反應，并能穩(wěn)定細胞膜，提高機體抗自由基損傷的能力。過多產生的NO易在氧自由基存在時轉變?yōu)檫^氧化亞硝酸，并通過自由基鏈式反應導致含巰基的蛋白和脂質氧化，從而造成組織損傷。本實驗結果表明熱瘀散能降低NO含量，減輕NO的殺傷毒性及其對組織細胞的損傷作用，減輕炎癥反應，促進潰瘍愈合。UC患者IL-6水平明顯升高可與TNF-α和IL-1α相互作用，導致UC活動期的特征性炎癥反應。IL-6含量的增高使大量的T細胞尤其是CD4+T細胞迅速分裂增殖，形成致敏淋巴細胞，又可活化粒細胞，增強NK細胞及LAK細胞殺傷力，從而增進炎癥反應。有實驗研究［3］結果顯示，通過觀測患者IL-6活性，可以反映疾病的活動度及其轉歸。熱瘀散能降低IL-6含量，從而減輕炎癥反應，改善機體的免疫功能，促進潰瘍愈合。IL-8升高程度與局部炎癥程度相一致，可作為UC早期診斷指標，對UC嚴重程度判斷有一定指導意義［4-5］。熱瘀散能降低IL-8含量，從而減輕炎癥反應，改善機體的免疫功能，促進潰瘍愈合。IL-10為Th2型細胞分泌，在黏膜免疫中是一種重要的細胞因子調節(jié)劑，在腸道黏膜內環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。Linehan等［6］認為IL-10抑制誘生型一氧化氮合酶（iNOS）的表達。目前各種針對補充IL-10的UC免疫治療在模型動物和臨床實驗中也都取得了良好效果［7］。所以，IL-10對有效判斷UC的病情程度有重要意義。本實驗結果表明熱瘀散能提高IL-10含量，從而減輕炎癥反應，改善機體的免疫功能，促進潰瘍愈合。TNF-α被公認為介導UC的細胞因子，屬于促炎因子。諸多報道顯示UC患者TNF-α分泌水平高于正常組或未受累結腸黏膜［8］。本實驗結果表明熱瘀散能降低TNF-α、提高IL-13水平，從而減輕炎癥反應，改善機體的免疫功能，促進潰瘍愈合。

綜上所述，主要通過中藥清熱化濕，益氣健脾，兼有活血化瘀作用，從而調節(jié)大鼠模型的免疫反應，減輕促炎因子的作用，增強抑炎因子的作用，以減輕甚至控制炎癥反應，以發(fā)揮療效。本實驗結果則又進一步證實UC的發(fā)病機理中，氧自由基誘發(fā)的脂質過氧化反應起著重要的作用。為免疫反應系UC發(fā)病的病機之一提供依據(jù)。

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