王金香 鄧愛軍

濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東濰坊 261041

川芎嗪對缺氧時視網膜血管內皮細胞HIF-1α、VEGF表達及細胞增殖的影響

王金香 鄧愛軍▲

濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東濰坊 261041

目的研究川芎嗪對缺氧時體外培養(yǎng)的牛眼視網膜血管內皮細胞（BREC）VEGF表達及細胞增殖活性的影響，探討川芎嗪治療視網膜新生血管性疾病的藥理機制及可行性。 方法CoCl2模擬缺氧處理培養(yǎng)的BREC細胞，用濃度分別為20、40、120 μg/mL的川芎嗪分別加入細胞培養(yǎng)液中24 h，采用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液VEGF含量，免疫組織化學法和生物熒光法分別檢測細胞PCNA的表達、細胞內ATP含量以分析細胞增殖能力，采用免疫組織化學法檢測HIF-1α的表達。 結果 川芎嗪可減少缺氧引起的視網膜血管內皮細胞中PCNA的表達，降低細胞內ATP含量，降低培養(yǎng)上清液中的VEGF濃度，且呈劑量依賴性。結論 川芎嗪可抑制缺氧引起的視網膜血管內皮細胞的增殖。其機制可能是通過抑制HIF-1α途徑來實現(xiàn)的。

川芎嗪；視網膜新生血管；血管內皮生長因子；缺氧誘導因子

筆者在缺氧時的牛眼視網膜血管內皮細胞（BREC）培養(yǎng)上清液中加入不同濃度的川芎嗪，研究其對HIF-1α表達的影響，及對體外培養(yǎng)的血管內皮細胞增殖的作用，探討川芎嗪的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

鹽酸川芎嗪注射液，由無錫市第七制藥有限公司生產，規(guī)格為40 mg/2 mL，批號010913。藥物用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。F12培養(yǎng)基（Gibco，美國）；兔抗HIF-1α多克隆抗體（武漢博士德）；胎牛血清（Gibco，美國）；EBM-2 Basal Meidum（北京畢特博）。免疫組化采用北京中山公司免疫組化試劑盒（二步法）。其他試劑皆為分析純。

1.2 BREC細胞的培養(yǎng)

取死后3 h內健康牛眼 （取自濰坊肉聯(lián)廠），70%酒精浸泡，角膜緣后4 mm剪開，剝出視網膜神經層，剪碎、勻漿，孔徑80 μm金屬篩網過濾， 洗脫液離心 （1 000 r/min，7 min），0.02%膠原酶Ⅰ消化（37℃，1～2 h），離心洗滌并收集細胞，接種于鼠尾膠原培養(yǎng)皿內，20%胎牛血清的M199和EBM-2混合培養(yǎng)液，放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)液次日更換繼續(xù)培養(yǎng)。以后每3天換液1次。長至近融合狀態(tài)時，用0.1%胰蛋白酶消化、傳代細胞。血管內皮細胞鑒定采用第Ⅷ因子相關抗原檢測法，純度為90%以上[1]。

1.3 細胞處理及分組

將對數生長期的BREC細胞分別以濃度1.5×105/mL細胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h，細胞分為以下3組：F12培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)組 （正常對照），模擬缺氧組（加入終濃度125 μmmol/L的CoCl2）和藥物治療組（加入含不同濃度川芎嗪 20、40、120 μg/mL），各組分別培養(yǎng)24 h，每項指標每組各測6個培養(yǎng)孔，分別取平均值。

1.4 培養(yǎng)上清液VEGF含量ELISA法測定

按照說明書步驟嚴格進行操作，在酶標儀波長492 nm比色定量。所有標本均作雙管檢查，對VEGF含量在標準曲線最高值以外的標本稀釋10～100倍后重新測定。

1.5 PCNA免疫組化

-10℃甲醇固定培養(yǎng)細胞5 min，用3%H2O2孵育5 min后沖洗，加入1∶100稀釋的一抗于4℃過夜，洗后滴加山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體，37℃孵育 20 min，PBS洗后以DAB顯色。陰性對照以PBS液代替一抗。結果以胞核內有棕黃色顆粒為陽性判定標準，高倍鏡下（×400）隨機選擇每張切片5個視野，采用計算機圖像分析系統(tǒng)進行灰度分析。

1.6 細胞內ATP含量測定

培養(yǎng)孔中加入煮沸的PBS 3 mL，振蕩后立即吸入試管中，沸水浴10 min后冰水冷卻，低溫離心13 000 r/min 15 min，將上清液試管置于冰水中待測。反應杯中加入樣品0.2 mL，放入熒光光度計反應暗室，微量進樣器向反應杯中注入熒光素-熒光素酶液0.8 mL，測定相對發(fā)光強度。按繪制好的ATP標準曲線計算出ATP含量。

1.7 HIF-1α免疫熒光染色

-10℃甲醇固定培養(yǎng)細胞5 min，沖洗后，0.3%H2O2吐溫30 min，PBS 洗 3 次，1∶100 稀釋的 RABBIT Anti-HIF-1α 細胞于4℃過夜，洗后滴加FITC標記山羊抗兔IgG抗體，37℃孵育60 min，PBS沖洗細胞后于熒光顯微鏡下觀察。陰性對照以PBS液代替一抗。結果判定以細胞核或胞漿呈綠色熒光為陽性標準，每張切片隨機選擇5個視野在高倍鏡下（×400）采用計算機圖像分析系統(tǒng)進行熒光分析。

1.8 數據處理

應用SPSS 10.0統(tǒng)計分析軟件包進行。數據均以均數±標準差（±s）表示，組間比較用t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血管內皮細胞培養(yǎng)上清液VEGF的檢測

表1顯示，缺氧時BREC細胞培養(yǎng)上清液中VEGF濃度增加，而不同濃度的川芎嗪可減少缺氧引起的VEGF增加，且呈劑量依賴性。當川芎嗪濃度為20 μg/mL時，其培養(yǎng)上清液VEGF水平已顯著下降（P<0.05）。見表1。

2.2 血管內皮細胞PCNA、HIF-1α的表達及ATP含量

表1顯示，缺氧時BREC細胞中PCNA、HIF-1α表達及ATP含量均增加，而不同濃度的川芎嗪可減少缺氧引起的PCNA、HIF-1α表達增加及ATP濃度升高，且呈劑量依賴性。當川芎嗪濃度為20 μg/mL時，其PCNA、HIF-1α表達及ATP含量水平已顯著下降（P<0.05）。見表1。

表1 川芎嗪對缺氧時BREC細胞HIF-1α、VEGF分泌及細胞增殖的影響（±s，n=6）

表1 川芎嗪對缺氧時BREC細胞HIF-1α、VEGF分泌及細胞增殖的影響（±s，n=6）

組別 川芎嗪劑量（μg/mL） VEGF（ng/L） PCNA ATP（ng/L） HIF-1α正常對照組缺氧組缺氧+藥物組--2 0 40 120 76.66±8.42 201.47±11.38 186.52±10.33 156.89±9.55 118.63±8.36 31.36±2.36 61.57±5.52 56.69±1.66 50.44±3.14 40.98±2.58 8.65±0.43 40.52±2.85 32.63±3.10 26.65±1.89 18.66±2.35 8.56±0.53 50.41±2.97 41.37±2.11 29.59±3.24 17.78±1.33

3 討論

川芎嗪化學名為四甲基吡嗪，近年以川芎總生物堿中分離出1號結晶為甲荃吡嗪，3號結晶為佩洛里因[2]。1號結晶藥理研究證明是一種新型鈣離子拮抗劑，有活血化瘀，抗血小板凝集，興奮延髓呼吸中樞及血管運動中樞，擴張血管及支氣管平滑肌，改善微循環(huán)等作用[3]。因其治療心腦血管疾病療效好、副作用少而廣泛用于臨床[4-6]。

本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)缺氧時BREC細胞中PCNA表達增加，細胞內ATP含量增加，而不同濃度的川芎嗪可減少缺氧引起的PCNA表達，降低細胞內ATP含量，且呈劑量依賴性。當川芎嗪濃度為20 μg/mL時，其PCNA表達、細胞內ATP含量已顯著下降（P<0.05）。表明川芎嗪可抑制缺氧引起的血管內皮細胞的增生。這與以往報道相符[5-8]。本實驗中同時發(fā)現(xiàn)缺氧時BREC細胞培養(yǎng)上清液VEGF增加，而不同濃度的川芎嗪可減少缺氧引起的VEGF增加，且呈劑量依賴性。當川芎嗪濃度為20 μg/mL時，其培養(yǎng)上清液中VEGF水平已顯著下降（P<0.05）。表明川芎嗪可抑制缺氧引起的血管內皮細胞VEGF分泌的增加。

本研究中，筆者還發(fā)現(xiàn)缺氧時誘導BREC細胞中HIF-1α表達增加，而不同濃度的川芎嗪可減少缺氧引起的HIF-1α表達，且呈劑量依賴性。當川芎嗪濃度為20 μg/mL時，其細胞中HIF-1α水平已顯著下降（P<0.05）。這可能提示川芎嗪還可以通過抑制HIF-1α途徑來抑制VEGF的表達，從而抑制血管內皮細胞的增殖活性，這在以往文獻[7-12]中未見報道。

綜上所述，川芎嗪可減少缺氧時的視網膜血管內皮細胞VEGF的分泌，從而抑制缺氧引起的視網膜血管內皮細胞的增殖。其機制可能是通過抑制HIF-1α途徑來實現(xiàn)的。

[1]鄧愛軍，姜德詠，杜瑋，等.缺氧誘導因子-1α反義寡核苷酸對缺氧時視網膜血管內皮細胞增殖活性影響的研究[J].中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2010，4（5）：603-607.

[2]Morita M，Ohneda O，Yamashita T，et al.HLF/HIF-2alpha is a key factor in retinopathy of prematurity in association with erythropoietin[J].Embo J，2003（22）：1134-1146.

[3]羅紅琳，袁淑蘭，肖靜.川芎嗪抗離體培養(yǎng)動脈平滑肌細胞作用的實驗研究[J].華西藥學雜志，1997，12（1）：6.

[4]林蓉，劉俊田，甘偉杰，等.川芎嗪對缺氧缺糖狀態(tài)下培養(yǎng)的血管內皮細胞 ECV2304 的影響[J].中國中藥雜志，2004，29（5）：462-464.

[5]蔡永敏.最新中藥藥理與臨床應用[M].北京：華夏出版社，1999：303-305.

[6]張曉丹，劉旺，周嘉輝，等.川芎嗪對DHF大鼠心肌損傷的保護作用及其機制研究[J].中國中藥雜志，2009，34（21）：2808-2812.

[7]王萬鐵，葉軍，毛朝鳴.川芎嗪治療慢性肝病的臨床研究[J].實用中西醫(yī)結合雜志，1998，11（11）：1001.

[8]鄧春雷，任鐵良.川芎嗪對培養(yǎng)牛肺動脈內皮細胞分泌NO、TF和TFPI的影響[J].中國醫(yī)師雜志，2001，3（6）：478-480.

[9]李斌，唐仕波，張革，等.人類視網膜血管內皮細胞的培養(yǎng)與鑒定[J].實驗研究，2005，23（1）：20-22.

[10]Joussen AM，Poulaki V，Le ML，et al.A central role for inflammation in the pathogenesis of diabetic retinopathy[J].FASES J，2004，18（12）：1450-1452.

[11]Kamiuchi K，Hasegawa G，Obayashi H，et al.Intercellular adhesion molecule-1 （ICAM-1） polymorphism is associated with diabetic retinopathy in Type 2 diabetes mellitus[J].Diabet Med，2002，19（5）：371-376.

[12]Tao H，Yao M，Zou S，et al.Effect of angiogenesis inhibitor Rg3 on the growth and metastasis of gastric cancer in SCI D mice[J].Zhonghua Wai Ke Za Zhi，2002，40（8）：606-608.

The influence of ligustrazine on HIF-1α,VEGF expression and cell proliferation in hypoxic retinal microvessels endothelial cells

WANG Jinxiang DENG Aijun▲
Weifang Medical College Affiliated Hospital,Weifang 261041,China

ObjectiveTo study the influence of ligustrazine on HIF-1α,VEGF expression and cell proliferation in hypoxic retinal microvessels endothelial cells,in order to explore the mechanisms and feasibility of ligustrazine in treatment of pharmacological.MethodsCoCl2 was used to simulate hypoxia training BREC cells,ligustrazine with a concentration of 20,40,120 μg/mL were added to the cell culture fluid 24 h，VEGF levels in cell culture supernatants were measured by ELISA.Immunohistochemical method were used to detect the expression of PCNA and bioluminescence,intracellular ATP content in order to analyze cell proliferation,immunohistochemical method was used to detect the expression of HIF-1α.ResultsTMP could reduce the expression of PCNA in hypoxia-induced retinal vascular endothelial cells,reduced the intracellular ATP content,reduced the concentration of VEGF in the culture supernatant,and it showed a dose-dependent manner.ConclusionLigustrazine can inhibit cell proliferation of hypoxic retinal microvessels endothelial cells.This effect might be related to its function of decreasing HIF-1α expression.

Ligustrazine;Retinal neovascularization;Vascular endothelial growth factor(VEGF);HIF-1α

R-33

A

1674-4721（2012）11（b）-0005-02

山東省博士基金資助項目（編號：2006BS03050）。

▲通訊作者

2012-09-24 本文編輯：林利利）