李 敏，王 斌，侯建平，楊 艷

（陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，咸陽(yáng) 712046）

肝纖維化是各種致病因子累及肝臟后的一種病理狀態(tài)，由各種慢性肝病引起，進(jìn)一步將發(fā)展為肝癌。盡管肝纖維化的病因不同，但其病理特點(diǎn)基本一致：肝臟星狀細(xì)胞（HSC）活化是肝纖維化形成的細(xì)胞基礎(chǔ)，以膠原為代表的肝臟細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）代謝失衡，生成大于降解是其生化學(xué)基礎(chǔ)。臨床若能在早期采取抗纖維化措施，有可能使之停止發(fā)展或逆轉(zhuǎn)[1]，對(duì)于多種慢性肝病治療有積極意義。中藥抗肝纖維化具有獨(dú)特療效，多采用舒肝理氣、活血化瘀類中藥，多年來實(shí)踐證明中醫(yī)藥在抗肝纖維化中具有良好作用與發(fā)展前景[2]。

柴胡、黃芩臨床常用于多種肝病的治療，具有較好抗肝纖維化作用[3-6]。有資料表明柴胡、黃芩配伍后保肝護(hù)肝作用明顯增強(qiáng)[7-10]，但兩藥配伍后如何發(fā)揮抗肝纖維化的協(xié)同作用，相關(guān)研究較少。本實(shí)驗(yàn)探討柴胡、黃芩及其配伍對(duì)抗肝纖維化的作用，闡明柴胡-黃芩抗肝纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)及作用機(jī)制，為柴胡及黃芩防治肝纖維化提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性SD大鼠40只（200±5）g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（陜）2007-001。

1.2 試劑 乙醇（國(guó)產(chǎn)分析純 天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；四氯化碳（CCl4）（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；膽固醇(成都市精誠(chéng)生化制品有限公司)；多聚甲醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；烏拉坦（上海華凱科技貿(mào)易公司）。透明質(zhì)酸（HA）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、層黏蛋白(LN)、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）（南京建成生物工程研究所、南京建成科技有限公司）。

1.3 藥材 柴胡（傘形科多年生草本植物，北柴胡的干燥根），黃芩（唇形科多年生草本植物黃芩的干燥根）。購(gòu)自百姓樂大藥房，經(jīng)鑒定為正品藥材。柴胡、黃芩、柴胡∶黃芩（2∶1）提取工藝如下：根據(jù)藥物理化性質(zhì)及臨床用藥習(xí)慣，采取水提取工藝，具體為浸泡0.5 h，第1次加7倍量水，煎煮0.5 h，第2次給藥渣中加5倍量水，煎煮0.5 h，過濾，合并濾液，濃縮為1.8 g/mL，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 電子天平（上海天普分析儀器有限公司型號(hào)：JH1102），水浴鍋（國(guó)華電器有限公司，型號(hào)：HH-2），酶標(biāo)儀（南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司，型號(hào)：DG5033A），離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠制造，型號(hào)：TDL80-2B）；烘箱（天津匯科儀器設(shè)備有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 肝纖維化模型復(fù)制 采用復(fù)合因素塑造肝纖維化大鼠模型，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，開始飲10%乙醇，飼喂高脂飼料（含玉米粉89.5%、豬油10%、膽固醇0.5%），1周后皮下注射40%四氯化碳（CCl4）橄欖油溶液5 mL/kg，以后根據(jù)大鼠體質(zhì)量變化情況，每周2次（周三、周六）皮下注射40%CCl4溶液3 mL/kg，連續(xù) 3 周。

2.2 分組給藥 大鼠按體質(zhì)量編號(hào)后采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組：即正常對(duì)照組、肝纖維化模型組、柴胡水煎液組（18 g/kg）、黃芩水煎液組（18 g/kg）、柴胡-黃芩合煎液組（18g/kg）。模型建立后，柴胡水煎液組、黃芩水煎液組、柴胡-黃芩（2∶1）合煎液組灌胃給藥10 mL/kg，模型組及正常對(duì)照組灌胃等量蒸餾水，每日1次，連續(xù)7 d。

2.3 HA、PCⅢ、LN和Ⅳ-C測(cè)定 第7天晚禁食不禁水12 h，次日腹腔注射烏拉坦（1.0 g/kg）麻醉，腹主靜脈取血，分離血清。按試劑盒說明書操作，用酶聯(lián)免疫吸附法（Elisa法）測(cè)定血清中HA、PCⅢ、LN、Ⅳ-C含量。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中HA、PCⅢ、LN和Ⅳ-C比正常對(duì)照組明顯升高。柴胡-黃芩（2∶1）能降低肝纖維化大鼠血清中HA、PCⅢ和Ⅳ-C的含量值，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；柴胡、黃芩及柴胡-黃芩（2∶1）均能降低血清LN，其中柴胡、黃芩作用顯著（P<0.05），柴胡-黃芩（2∶1）作用非常顯著（P<0.01）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血清中HA、PCⅢ、LN和Ⅳ-C的含量（±s，n=8）Tab.1 Content of serum HA,PCⅢ,LN andⅣ-C in each group(±s，n=8)

表1 各組大鼠血清中HA、PCⅢ、LN和Ⅳ-C的含量（±s，n=8）Tab.1 Content of serum HA,PCⅢ,LN andⅣ-C in each group(±s，n=8)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別 劑量（g/kg）PCⅢ Ⅳ-C HA LN正常對(duì)照組 - 8.85±2.79**22.55±5.84*153.25± 6.85**34.50±2.96**模型組 - 16.82±4.2129.63±6.03227.86±18.7450.57±6.64柴胡組 1812.50±2.6427.33±2.46179.87±10.1740.76±5.70*黃芩組 1813.45±1.7828.44±7.91189.61±11.3443.49±3.81*柴胡-黃芩組 12+610.50±2.64* 26.36±2.92*154.31± 9.47* 39.12±6.39**

4 討論

大多數(shù)肝硬化都是由肝纖維化的各種慢性肝病發(fā)展引起，因此能在肝纖維化早期進(jìn)行抑制或逆轉(zhuǎn)，對(duì)于各種慢性肝病有積極治療意義。

參與肝纖維化形成的細(xì)胞外基質(zhì)成分包括膠原蛋白、蛋白多糖和非膠原性蛋白。HA是構(gòu)成蛋白多糖的主要成分，肝臟受損時(shí)，HSC合成的HA會(huì)明顯增加，而內(nèi)皮細(xì)胞受損使血液中的HA攝取和降解減少，因而血液中HA水平升高。Ⅲ型前膠原反映肝內(nèi)Ⅲ型膠原合成，血清PCⅢ含量增高與肝細(xì)胞炎性反應(yīng)和壞死導(dǎo)致肝內(nèi)Ⅲ型膠原裂解增加有關(guān)，直接反映Ⅲ型膠原的代謝狀況。LN大量沉積可引起肝竇毛細(xì)血管化，其血清值是反映基底膜更新率的指標(biāo)，可反映肝竇的毛細(xì)血管化和匯管區(qū)纖維化。Ⅳ－C是基底膜的主要成分，反映基底膜膠原的更新率，與肝纖維化程度呈正相關(guān)。因此肝纖維化時(shí)HA、PCⅢ和Ⅳ-C的含量變化最明顯，是反映肝纖維化最敏感的指標(biāo)[11]。

柴胡、黃芩是臨床常用的抗肝纖維化中藥，對(duì)其相關(guān)機(jī)制有一定深入的研究，柴胡是通過抑制肝炎和肝星狀細(xì)胞活化，其中深層機(jī)制可能與上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR-γ）表達(dá)有關(guān)[3-4]。黃芩抗肝纖維化作用，包括減少肝臟羥脯氨酸含量，降低肝區(qū)平滑肌細(xì)胞α-肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性表達(dá)，激活caspase-3，caspase-9，促進(jìn)ERK-P53的途徑，導(dǎo)致最終HSC-T6細(xì)胞凋亡，降低血清酶學(xué)異常，能改善肝纖維化病理形態(tài)等[5-6]。兩者配伍顯示出增強(qiáng)的保肝作用，其中以柴胡-黃芩（2∶1）效果為佳[7]，故本實(shí)驗(yàn)柴胡-黃芩（2∶1）配伍探討其抗肝纖維化效應(yīng)。

復(fù)合因素（包括高脂飼料、乙醇和CCl4）的給與是一種快速可靠復(fù)制肝纖維化模型的方法[12]，因此作為實(shí)驗(yàn)造模方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中HA、PCⅢ、LN和Ⅳ-C比正常對(duì)照組明顯升高。柴胡-黃芩（2∶1）能降低肝纖維化大鼠血清中HA、PCⅢ和Ⅳ-C 的含量值（P<0.05）；柴胡、黃芩及柴胡-黃芩（2∶1）均能降低血清 LN，其中柴胡、黃芩作用顯著（P<0.05），柴胡-黃芩（2∶1）作用非常顯著（P<0.01）。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，柴胡-黃芩（2∶1）配伍治療肝纖維化比柴胡、黃芩單味中藥效果更明顯。其作用機(jī)制可能與配伍藥物相互之間體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)影響有關(guān)。針對(duì)這些方面，有必要進(jìn)一步結(jié)合藥代動(dòng)力學(xué)研究，探討肝纖維化狀態(tài)下的藥物配伍后代謝行為對(duì)藥效影響。

[1]程明亮，楊長(zhǎng)青.肝纖維化的基礎(chǔ)研究及臨床[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:1.

[2]張 杰，徐列明.中醫(yī)藥治療實(shí)驗(yàn)性肝纖維化作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2003，1(2):142-145.

[3]Lee TF,Lin YL,Huang YT.Protective effects of kaerophyllin against liver fibrogenesis in rats[J].European journal of clinical investigation,2012,42(6):607-616.

[4]Lu XL,He SX,Ren MD,et al.Chemopreventive effect of saikosaponin-d on diethylinitrosamine-induced protein beta and cyclooxygenase-2[J].Molecularmedicinereports,2012,5(3):637-644.

[5]Nan JX,Park EJ,Kim YC,et al.Scutellaria baicalensis inhibits liver fibrosisinducedbybileductligationorcarbontetrachlorideinrats[J].The Journal of pharmacy and pharmacology,2002,54(4):555-563.

[6]Pan TL,Wang PW,Leu YL,et al.Inhibitory effects of Scutellaria baicalensis extract on hepatic stellate cells through inducing G(2)/M cell cycle arrest and activating ERK-dependent apoptosis via Bax and caspase pathway[J].Journal of ethnopharmacology,2012,139(3):829-837.

[7]王憲齡，李 偉，劉方洲，等.柴胡黃芩配伍對(duì)CCl4所致小鼠急性肝損傷的研究[J].中藥藥理與臨床，2005，21（6）：11－13.

[8]高 琳，謝 鳴.柴胡－黃芩合煎與分煎液的保肝作用比較[J].中成藥，2004，26（11）：942－943.

[9]宋星星，蘇金玲，畢業(yè)東，等.五田保肝液對(duì)酒精性肝纖維化大鼠肝組織 TGF-β1 表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[J].天津中醫(yī)藥，2010，27（6）：490-492.

[10]蘇金玲，畢業(yè)東，姜希娟，等.ILK、TNF-α在酒精性肝纖維化大鼠肝組織中的表達(dá)及五田保肝液酸干預(yù)作用[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，31（1）：20-22.

[11]韋 卉，李金萬.肝纖維化指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)與臨床意義[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2008，19（5）：1182－1183.

[12]高愛梅，平 潔，汪 暉.吲哚-3-原醇對(duì)復(fù)合因素所致肝纖維化大鼠的治療作用及部分機(jī)制研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27（6）：764－769.