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        紫花地丁總黃酮和多糖對D-半乳糖致衰小鼠血清中過氧化氫酶活性的影響*

        2012-11-29 00:49:12段建榮嚴貴亮
        天津中醫(yī)藥 2012年6期
        關(guān)鍵詞:紫花地丁半乳糖低劑量

        段建榮,嚴貴亮

        (河北省張家口市沙嶺子醫(yī)院藥劑科,張家口 075000)

        紫花地丁為堇菜科植物紫花地丁(Viola yedoensis Makino)的全草。中國各地均有生長。紫花地丁具有清熱解毒,涼血消腫的功效,主治黃疸、痢疾、乳腺炎、目赤腫痛、咽炎;外敷治跌打損傷、癰腫、毒蛇咬傷等。含有為黃酮、多糖、香豆素、揮發(fā)油等成分[1-2]。筆者對紫花地丁總黃酮及多糖進行了提取,并研究了總黃酮和多糖對D-半乳糖致衰小鼠血清中過氧化氫酶活性的影響。

        1 材料

        1.1 儀器 U-3900紫外可見分光光度計(日本日立儀器有限公司),KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),MP1100B型電子天平(上海精科天平儀器廠),高速冷凍離心機(Sigma Microelectronics Co.Ltd)。

        1.2 試劑與藥品 藥材紫花地丁采自河北張家口,由張家口市第一醫(yī)院中醫(yī)科主任,鄭秀英教授鑒定為紫花地丁(Viola yedoensis Makino),D-半乳糖(分析純,上海試一化學(xué)試劑有限公司),過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(由南京建成生物工程研究所提供),其他試劑均為國產(chǎn)分析純,實驗用水為去離子水。

        1.3 實驗動物 健康的昆明種小鼠120只(雌雄各半),購買于河北北方學(xué)院實驗動物中心,分籠飼養(yǎng),室溫18~25℃,空氣新鮮,通風良好,自由攝食、飲水。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 紫花地丁總黃酮的提取 紫花地丁粉碎后置于60℃干燥箱中恒溫干燥24 h,稱取一定量的紫花地丁粉末,用70%乙醇恒溫浸提,提取液加4%NaOH溶液萃取,18%HCl液酸化NaOH液,乙酸乙酯萃取,減壓蒸干乙酸乙酯,加乙醇溶解,制成濃度為1mL/g紫花地丁藥材的總黃酮溶液。

        2.2 紫花地丁總黃酮的含量測定[3]準確稱取蘆丁對照品10.0 mg置于25 mL容量瓶中,加70%乙醇溶解定容作為母液,從母液中精密量取0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 分別置于 25 mL 容量瓶中,用70%乙醇定容至刻度,搖勻,用70%乙醇作為空白對照,在510 nm波長處測吸光度值。以濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標,繪制標準工作曲線,標準曲線方程為A=1.181 0x-0.ue=1,r=0.9990。根據(jù)標準曲線求得紫花地丁總黃酮含量。按下式計算總黃酮得率為0.9032%。

        2.3 紫花地丁多糖的提取[4]稱取一定量的紫花地丁粉末,經(jīng)95%乙醇浸提3次,藥渣置室溫干燥。稱取一定量藥渣,加入10倍量的蒸餾水,煎煮2 h,濾過,加入4倍體積的無水乙醇,攪勻,靜置過夜,抽濾,所得沉淀依次用適量無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌,置干燥箱中干燥,稱質(zhì)量。精密稱取多糖適量,加水溶解,制成濃度為1mL/g紫花地丁藥材的多糖溶液。

        2.4 紫花地丁多糖的含量測定[5]精密稱取105℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖100 mg,置100 mL的容量瓶中,加水溶解定容,搖勻,配成葡萄糖標準溶液。精密量取葡萄糖標準溶液適量,分別加水稀釋制成0.04、0.05、0.06、0.07、0.08 mg/mL 的溶液,搖勻。分別精密吸取上述不同濃度溶液1.0 mL,置錐形瓶中,加入1.0 mL苯酚溶液,搖勻,迅速加入濃硫酸5.0 mL,立即搖勻,室溫放置30 min,平行空白,在490 nm波長處測定吸光度,以吸光度為縱坐標,葡萄糖的濃度為橫坐標,繪制標準曲線,標準曲線方程為A=9.956 9C+0.ue=1,r=09992。根據(jù)標準曲線求得紫花地丁多糖濃度。按下式計算多糖得率為13.56%。

        2.5 紫花地丁總黃酮和多糖對D-半乳糖致衰小鼠血清中CAT活性的影響

        2.5.1 供試溶液的制備 量取適“2.1紫花地丁總黃酮的提取”項下制備的總黃酮溶液,減壓蒸干乙醇后,加適量水制備為濃度為0.4 mg/mL的溶液。作為總黃酮供試溶液。量取“2.3紫花地丁多糖的提取”項下制備的多糖溶液,加水稀釋至濃度為0.4 mg/mL作為多糖供試溶液。

        2.5.2 動物造模給藥 健康的昆明種小鼠80只(雌雄各半),采用隨機數(shù)字表法隨機分為空白對照組、模型對照組、紫花地丁總黃酮高、中、低劑量組、紫花地丁多糖高、中、低劑量組,適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后雌雄分開。

        小鼠腹腔注射D-半乳糖[200 mg/(kg·d)],制備亞急性衰老模型[6]??瞻讓φ战M注射等體積生理鹽水。各治療組從第9周開始每日上午分別灌胃給藥,空白對照組和模型對照組給等體積的生理鹽水,紫花地丁總黃酮、多糖高劑量組40 mg/kg,紫花地丁總黃酮、多糖中劑量組20 mg/kg,紫花地丁總黃酮、多糖低劑量組10 mg/kg,連續(xù)8周。

        2.5.3 取材與檢測[7-8]末次給藥后,小鼠斷頭取血,以4000 r/min離心10 min,取血清,按試劑盒說明,檢測CAT活力。結(jié)果見表1。

        2.5.4 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行處理,計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        表1 紫花地丁總黃酮和多糖對D-半乳糖致衰小鼠血清中過氧化氫酶的活性的影響(±s)Tab.1 Effects of Flavonoid and Polysaccharides in Viola yedoensis Makino on serum CAT in D-galactose induced aging mouse(±s)

        表1 紫花地丁總黃酮和多糖對D-半乳糖致衰小鼠血清中過氧化氫酶的活性的影響(±s)Tab.1 Effects of Flavonoid and Polysaccharides in Viola yedoensis Makino on serum CAT in D-galactose induced aging mouse(±s)

        注:與模型組比較,▲P<0.05,△P<0.01。

        組別 劑量(mg/kg)n CAT(U/mL)空白組 01072.15±16.42△模型組 01036.38±10.54總黃酮組 401061.28±13.56△201057.47±11.24△101048.39±12.75▲多糖組 401056.20±13.91△201048.34±10.27▲101042.15±11.20▲

        3 討論

        D-半乳糖所致的亞急性衰老模型,是細胞內(nèi)糖代謝紊亂,導(dǎo)致機體抗氧化防御系統(tǒng)破壞,大量的自由基積聚,過氧化脂質(zhì)、脂褐質(zhì)等增高,導(dǎo)致擬衰老變化,是一種較為理想的模型。已經(jīng)廣泛應(yīng)用于衰老機制、老年疾病、抗衰老藥物篩選等方面的研究[9-10]。

        實驗結(jié)果表明模型對照組的CAT活力顯著低于正常對照組(P<0.05);各治療組的CAT含量明顯高于模型對照組(P<0.05)。

        紫花地丁總黃酮中、低劑量組提高小鼠血清CAT的活力的作用強于紫花地丁多糖中、低劑量組(P<0.05),兩者高劑量組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

        本實驗結(jié)果表明,紫花地丁總黃酮和多糖可提高機體內(nèi)CAT的活性,消除體內(nèi)過多的自由基,從而阻斷自由基對機體的破壞,產(chǎn)生延緩和預(yù)防衰老的作用。

        [1]陳胡蘭,董小萍,張 梅,等.紫花地丁化學(xué)成分研究[J].中草藥,2006,41(6):874-878.

        [2]肖永慶,畢俊英,劉曉宏,等.地丁化學(xué)成分的研究[J].植物學(xué)報,1987,29(5):542-536.

        [3]李喜鳳,郝 哲,杜云鋒.蒲公英中總黃酮提取工藝的研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(7):1695-1696.

        [4]劉萬水.馬齒莧多糖的提取與精制[J].天津中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2002,21(4):39.

        [5]楊 輝,李秀榮.不同產(chǎn)地桃葉鴉蔥多糖的含量測定[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2010,31(5):59-61.

        [6]張石寧,陳 明,肖 紅.D-半乳糖致衰老模型的研究[J].臨床精神醫(yī)學(xué)雜志,1998,8(6):327-328.

        [7]于 濤,于建春,陸明霞.針刺對快速老化小鼠SAMP10氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達的影響[J].天津中醫(yī)藥,2004,21(4):281-284.

        [8]王 筠,張軍平.中藥血清藥理學(xué)實驗方法研究概況[J].天津中醫(yī)藥,2005,22(1):86-88.

        [9]劉洪濤,柴 霞,郭永祥.補腎方對亞急性衰老大鼠模型總抗氧化力影響的實驗研究[J].天津中醫(yī)藥,2008,25(5):404-405.

        [10]徐軍娟.中醫(yī)藥用于抗衰防病的體會[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2002,19(3):18.

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