段建榮，嚴(yán)貴亮

（河北省張家口市沙嶺子醫(yī)院藥劑科，張家口 075000）

紫花地丁為堇菜科植物紫花地?。╒iola yedoensis Makino）的全草。中國各地均有生長。紫花地丁具有清熱解毒，涼血消腫的功效，主治黃疸、痢疾、乳腺炎、目赤腫痛、咽炎；外敷治跌打損傷、癰腫、毒蛇咬傷等。含有為黃酮、多糖、香豆素、揮發(fā)油等成分[1-2]。筆者對(duì)紫花地丁總黃酮及多糖進(jìn)行了提取，并研究了總黃酮和多糖對(duì)D-半乳糖致衰小鼠血清中過氧化氫酶活性的影響。

1 材料

1.1 儀器 U-3900紫外可見分光光度計(jì)（日本日立儀器有限公司），KQ-500B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），MP1100B型電子天平（上海精科天平儀器廠），高速冷凍離心機(jī)（Sigma Microelectronics Co.Ltd）。

1.2 試劑與藥品 藥材紫花地丁采自河北張家口，由張家口市第一醫(yī)院中醫(yī)科主任，鄭秀英教授鑒定為紫花地?。╒iola yedoensis Makino），D-半乳糖(分析純，上海試一化學(xué)試劑有限公司)，過氧化氫酶（CAT）測(cè)定試劑盒（由南京建成生物工程研究所提供），其他試劑均為國產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康的昆明種小鼠120只（雌雄各半），購買于河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，分籠飼養(yǎng)，室溫18～25℃，空氣新鮮，通風(fēng)良好，自由攝食、飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 紫花地丁總黃酮的提取 紫花地丁粉碎后置于60℃干燥箱中恒溫干燥24 h，稱取一定量的紫花地丁粉末，用70%乙醇恒溫浸提，提取液加4%NaOH溶液萃取，18%HCl液酸化NaOH液，乙酸乙酯萃取，減壓蒸干乙酸乙酯，加乙醇溶解，制成濃度為1mL/g紫花地丁藥材的總黃酮溶液。

2.2 紫花地丁總黃酮的含量測(cè)定[3]準(zhǔn)確稱取蘆丁對(duì)照品10.0 mg置于25 mL容量瓶中，加70%乙醇溶解定容作為母液，從母液中精密量取0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 分別置于 25 mL 容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，用70%乙醇作為空白對(duì)照，在510 nm波長處測(cè)吸光度值。以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=1.181 0x-0.ue=1，r=0.9990。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得紫花地丁總黃酮含量。按下式計(jì)算總黃酮得率為0.9032%。

2.3 紫花地丁多糖的提取[4]稱取一定量的紫花地丁粉末，經(jīng)95%乙醇浸提3次，藥渣置室溫干燥。稱取一定量藥渣，加入10倍量的蒸餾水，煎煮2 h，濾過，加入4倍體積的無水乙醇，攪勻，靜置過夜，抽濾，所得沉淀依次用適量無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，置干燥箱中干燥，稱質(zhì)量。精密稱取多糖適量，加水溶解，制成濃度為1mL/g紫花地丁藥材的多糖溶液。

2.4 紫花地丁多糖的含量測(cè)定[5]精密稱取105℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖100 mg，置100 mL的容量瓶中，加水溶解定容，搖勻，配成葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，分別加水稀釋制成0.04、0.05、0.06、0.07、0.08 mg/mL 的溶液，搖勻。分別精密吸取上述不同濃度溶液1.0 mL，置錐形瓶中，加入1.0 mL苯酚溶液，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，立即搖勻，室溫放置30 min，平行空白，在490 nm波長處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=9.956 9C+0.ue=1，r=09992。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得紫花地丁多糖濃度。按下式計(jì)算多糖得率為13.56%。

2.5 紫花地丁總黃酮和多糖對(duì)D-半乳糖致衰小鼠血清中CAT活性的影響

2.5.1 供試溶液的制備 量取適“2.1紫花地丁總黃酮的提取”項(xiàng)下制備的總黃酮溶液，減壓蒸干乙醇后，加適量水制備為濃度為0.4 mg/mL的溶液。作為總黃酮供試溶液。量取“2.3紫花地丁多糖的提取”項(xiàng)下制備的多糖溶液，加水稀釋至濃度為0.4 mg/mL作為多糖供試溶液。

2.5.2 動(dòng)物造模給藥 健康的昆明種小鼠80只（雌雄各半），采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、紫花地丁總黃酮高、中、低劑量組、紫花地丁多糖高、中、低劑量組，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后雌雄分開。

小鼠腹腔注射D-半乳糖[200 mg/（kg·d）]，制備亞急性衰老模型[6]?？瞻讓?duì)照組注射等體積生理鹽水。各治療組從第9周開始每日上午分別灌胃給藥，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給等體積的生理鹽水，紫花地丁總黃酮、多糖高劑量組40 mg/kg，紫花地丁總黃酮、多糖中劑量組20 mg/kg，紫花地丁總黃酮、多糖低劑量組10 mg/kg，連續(xù)8周。

2.5.3 取材與檢測(cè)[7-8]末次給藥后，小鼠斷頭取血，以4000 r/min離心10 min，取血清，按試劑盒說明，檢測(cè)CAT活力。結(jié)果見表1。

2.5.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 紫花地丁總黃酮和多糖對(duì)D-半乳糖致衰小鼠血清中過氧化氫酶的活性的影響（±s）Tab.1 Effects of Flavonoid and Polysaccharides in Viola yedoensis Makino on serum CAT in D-galactose induced aging mouse（±s）

表1 紫花地丁總黃酮和多糖對(duì)D-半乳糖致衰小鼠血清中過氧化氫酶的活性的影響（±s）Tab.1 Effects of Flavonoid and Polysaccharides in Viola yedoensis Makino on serum CAT in D-galactose induced aging mouse（±s）

注：與模型組比較，▲P＜0.05，△P＜0.01。

組別 劑量（mg/kg）n CAT（U/mL）空白組 01072.15±16.42△模型組 01036.38±10.54總黃酮組 401061.28±13.56△201057.47±11.24△101048.39±12.75▲多糖組 401056.20±13.91△201048.34±10.27▲101042.15±11.20▲

3 討論

D-半乳糖所致的亞急性衰老模型，是細(xì)胞內(nèi)糖代謝紊亂，導(dǎo)致機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)破壞，大量的自由基積聚，過氧化脂質(zhì)、脂褐質(zhì)等增高，導(dǎo)致擬衰老變化，是一種較為理想的模型。已經(jīng)廣泛應(yīng)用于衰老機(jī)制、老年疾病、抗衰老藥物篩選等方面的研究[9-10]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明模型對(duì)照組的CAT活力顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.05）；各治療組的CAT含量明顯高于模型對(duì)照組（P＜0.05）。

紫花地丁總黃酮中、低劑量組提高小鼠血清CAT的活力的作用強(qiáng)于紫花地丁多糖中、低劑量組（P＜0.05），兩者高劑量組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紫花地丁總黃酮和多糖可提高機(jī)體內(nèi)CAT的活性，消除體內(nèi)過多的自由基，從而阻斷自由基對(duì)機(jī)體的破壞，產(chǎn)生延緩和預(yù)防衰老的作用。

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