丁志明，武海闊，王 軍

（天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院外科，天津 300193）

膠原蛋白是蛋白質(zhì)的一種，是細胞外基質(zhì)（ECM）的主要成分，既往研究表明膠原蛋白升高是導致組織器官纖維化的重要原因之一[1]。糖尿病周圍血管病變中，血管纖維化可能是重要致病因素，與膠原蛋白的關(guān)系較為密切，本實驗目的在于對中藥干預下的糖尿病大鼠動脈損傷模型的膠原蛋白的表達進行研究，為糖尿病大鼠動脈損傷纖維病變學說和中藥干預糖尿病血管并發(fā)癥的可行性提供實驗學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠48只，清潔級，2月齡，體質(zhì)量 200～250 g。

1.1.2 實驗藥物 加味桃核承氣湯（桃仁10 g，大黃 6 g，桂枝 6 g，甘草 3 g，芒硝 6 g，黃芪 30 g，生地15 g，麥門冬 12 g，玄參 12 g），減壓濃縮至濃度為0.76 g/mL，大鼠用藥劑量為6.07 g/（kg·d），4℃冰箱冷藏備用；鹽酸二甲雙胍片，研碎，與生理鹽水配成0.1%的溶液，大鼠用藥劑量為0.14 g/（kg·d），相當于人的等效劑量；精蛋白鋅胰島素注射液；生理鹽水。

1.1.3 實驗儀器 血糖儀、顯微鏡、CMOS、多功能真彩色細胞圖象分析管理系統(tǒng)、切片機、離心機、電子天平、移液器、干燥箱、低溫冰箱、恒溫水浴箱、醫(yī)用微波爐等。

1.1.4 實驗試劑 SP免疫組化試劑盒、濃縮型DAB顯色劑試劑盒、多聚賴氨酸、兔抗鼠TGFβ1多克隆抗體、枸櫞酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液（PBS）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 共48只大鼠，按照隨機數(shù)字表法隨機分為：A-正常對照組（n=12），B-糖尿病對照組（n=12），C-中藥治療組（n=12），D-二甲雙胍治療組（n=12）。其中 A 組為正常血糖組；B、C、D 3組共36只大鼠造糖尿病模型。

1.2.2 實驗干預 B、C、D組共36只大鼠成功造模后，全部予普通飼料喂養(yǎng)，每日予適量長效胰島素皮下注射，前5周每周2次尾靜脈取血測血糖，后7周每周1～2次監(jiān)測血糖。維持非禁食狀態(tài)血糖25 mmol/L左右。

同時，A組和B組每日1次予0.9%生理鹽水10 mL/kg灌胃，C組每日1次按10 mL/kg給予中藥灌胃，D組每日1次予二甲雙胍0.14 g/kg溶于10 mL生理鹽水中灌胃。

1.3 檢測分析

1.3.1 觀察指標 膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ。

1.3.2 取材方法 嚴格按照上述方法飼養(yǎng)12周后，所有大鼠禁食24 h后，用10%的水合氯醛3 g/kg麻醉。手術(shù)分離股動脈約4～5 cm，兩端剪斷，PBS沖洗。

1.3.3 標本固定、包埋、切片 用4%多聚甲醛進行固定，經(jīng)70%、80%、90%、95%、100%乙醇分別30 min兩次、二甲苯透明30min兩次、55℃石蠟中30min兩次、用銅制模具包埋組織塊；將厚度5 μm的組織切片附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60℃過夜。

1.3.4 標本膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ免疫組化檢測 鏡觀采相分析：以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顆粒。定量分析采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)，每張切片在高倍鏡下（×400）隨機選取10個視野并攝像保存，采用IMAGE PRO PLUS軟件設(shè)置陽性表達的宏程序，在同一條件下，分析不同組別的膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ含量，對陽性表達率進行組間比較。

1.4 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)用SPSS18.0軟件處理，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。計量資料兩組間比較采用單因素方差分析作統(tǒng)計學處理，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 大鼠的存活情況 各組死亡大鼠：A組3只（原因不明），C組3只（糖尿病高滲昏迷、低血糖、胃注致大鼠窒息）。實驗結(jié)束時各組實驗大鼠數(shù)量為：A 組（n=9），B 組（n=12），C 組（n=9），D 組（n=12）。

2.2 各組大鼠血糖比較 實驗結(jié)束時，各糖尿病模型組（B、C、D組）血糖與正常對照組（A組）血糖比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；各糖尿病模型組（B、C、D組）血糖比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.3 各組股動脈膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ表達水平比較 見表1。

表1 各組股動脈膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ表達水平比較（±s）Tab.1 Comparison of expression of collagen proteinⅠand III in femoral artery of each groups（±s）

表1 各組股動脈膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ表達水平比較（±s）Tab.1 Comparison of expression of collagen proteinⅠand III in femoral artery of each groups（±s）

注：各實驗組與正常對照組比較，*P＜0.05；藥物干預組與糖尿病對照組比較，▲P＜0.05；中藥治療組與二甲雙胍治療組比較，＃P＜0.05。

組別 鼠數(shù)（n）膠原蛋白Ⅰ 膠原蛋白Ⅲ正常對照組（A組）91.457±0.1681.247±0.283糖尿病對照組（B組）126.115±0.676* 4.325±0.316*中藥治療組（C 組）92.865±0.304*▲＃ 1.942±0.168*▲＃二甲雙胍治療組（D組）123.295±0.306*▲ 2.875±0.455*▲

糖尿病造模組與正常對照組比較：膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中藥治療組、二甲雙胍治療組與糖尿病對照組比較：膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。中藥治療組與二甲雙胍治療組比較：膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ均有降低，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠免疫組化圖像觀察及分析 1）膠原蛋白Ⅰ：膠原蛋白Ⅰ抗體主要在黏膜下層細胞漿表達，正常對照組大鼠胞漿有散在黃色物質(zhì)，呈弱陽性改變；造模組血管黏膜下層細胞漿可見大量棕黃色物質(zhì)表達呈強陽性反應(yīng)。治療后，與對照組比較，中藥治療組膠原蛋白Ⅰ表達明顯下降（P＜0.05），二甲雙胍對膠原蛋白Ⅰ表達有影響，與中藥治療組有差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2）膠原蛋白Ⅲ：膠原蛋白Ⅲ抗體主要在細胞漿表達。正常對照組大鼠胞漿有散在黃色物質(zhì)，呈弱陽性改變；造模組膠原蛋白Ⅲ表達明顯多的棕黃色顆粒物質(zhì)，呈強陽性反應(yīng)。治療后，與對照組比較，中藥治療組膠原蛋白Ⅲ表達明顯下降（P＜0.05），二甲雙胍對膠原蛋白Ⅲ表達有影響，與中藥治療組有差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

組織器官纖維化是以膠原蛋白為主的ECM的合成與降解失衡為基礎(chǔ)，最終導致ECM過度沉積的復雜病理生理過程。在進行性纖維化為主要特征的糖尿病大血管病變中，膠原蛋白常是導致纖維化的最后共同中介物之一[2-3]，因此對于抗膠原蛋白在血管內(nèi)膜下過度沉積以阻止血管纖維化的形成具有重要意義。

本實驗通過建立糖尿病大鼠動脈損傷模型，對糖尿病大鼠動脈損傷模型的膠原蛋白的表達進行研究分析，揭示了糖尿病大鼠動脈損傷中膠原蛋白的高表達，為糖尿病大鼠動脈損傷纖維病變學說提供實驗學依據(jù)。同時觀察益氣養(yǎng)陰、活血化瘀中藥“加味桃核承氣湯”對膠原蛋白在血管中表達的影響，總結(jié)出此方能明顯降低膠原蛋白在血管內(nèi)膜的沉積，為中藥干預糖尿病血管并發(fā)癥的可行性和必要性提供依據(jù)。

總之糖尿病血管病變的發(fā)生發(fā)展機制受多種因素影響，至今仍沒有某一種學說能完全解釋其發(fā)病機制[4-5]。本課題屬于探索性研究糖尿病大血管病變機制，主要從纖維化角度探討糖尿病大血管病變，為了解糖尿病血管纖維化形成的機制及早期預測、診斷和治療提供創(chuàng)新性思路方面具有重大意義，通過對益氣養(yǎng)陰活血化瘀中藥的療效觀察，部分揭示中藥在預防和治療糖尿病大血管病變及糖尿病足中的優(yōu)勢，相信隨著研究的不斷深入，將為防治糖尿病血管并發(fā)癥開啟新的切入點。

[1]Tsukada S,Parsons CJ,Rippe RA.Mechanisms of liver fibrosis[J].Clinica Chimica Acta,2006,364:33-60.

[2]高俊杰，潘曉黎，吳 偉，等.轉(zhuǎn)化生長因子-β1和膠原蛋白與糖尿病心肌纖維化的實驗研究[J].中國老年學雜志,2006，（4）：505-507.

[3]Lotersztajn S,Julien B,Teixeira-Clerc F,et al.Hepatic Fibrosis:Molecular Mechanisms and Drug Targets[J].Annu.sRev PharmacolToxicol,2005,45:605-628.

[4]馬 燕，陳勁松，張柏林.益腎化瘀沖劑治療早期糖尿病腎病臨床觀察及對Hcy和NAG的影響[J].天津中醫(yī)藥，2012，29（4）：335-337.

[5]蘇金玲，畢業(yè)東，姜希娟，等.ILK、TNFα在酒精性肝纖維化大鼠肝組織中的表達及五田保肝液的干預作用[J].天津中醫(yī)藥大學學報，2011，31（1）：20-22.