李巧芬，常 柏

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院，天津 300070）

糖尿病難治性潰瘍是導(dǎo)致糖尿病患者截肢致殘的主要原因。隨著全球性糖尿病患病人數(shù)的增加，糖尿病患者人均壽命的延長以及老齡化的趨勢(shì)，因糖尿病潰瘍而需要截肢的患者也在增加[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)1996年全球糖尿病患者為1.2億，預(yù)計(jì)到2025年，將達(dá)到2.5億以上，而大約15%的糖尿病患者將發(fā)生潰瘍或壞疽[2]。筆者應(yīng)用生肌象皮膏在臨床上治療糖尿病潰瘍?nèi)〉昧己眯Ч鸞3]，下面筆者對(duì)2型糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面肉芽組織的胰島素樣生長因子-1及受體的含量的動(dòng)態(tài)觀察，探討生肌象皮膏促進(jìn)糖尿病大鼠難治性潰瘍愈合的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠，雄性，清潔級(jí)，體質(zhì)量（180±20）g，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2010-0034。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 氯仿、異丙醇、無水乙醇、（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究中心）；RNase-free離心管；200μL和 1000 μL Tips；Tris、DEPC（美國 Sigma 公司）；RT-PCR一步法試劑盒、引物合成、PCR小管、1.5 mL離心管（RNase free、寶生物工程有限公司）；TRIZOL Reagent（Invitrogen公司）。引物：IGF-ⅠRF：5-CGCTGTGTGGACCGGGATTT；IGF-ⅠRR:5-GCATGCACTCGCCATCGTG；IGFF：5-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC；IGFR：5-GAAGATGGTGATGGGATTTC，由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Universal 16R低溫高速離心機(jī)（Beckman公司）；BIPrisnxr7000PCR儀（PE公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

2.1 動(dòng)物模型的制備 160只雄性Wistar大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取40只作為正常對(duì)照組，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，其余120只為造模組給予高脂飼料喂養(yǎng)。8周后，空腹眼眶采血測空腹血糖和胰島素計(jì)算胰島素敏感指數(shù)（ISI=Ln[（FBG）（FINS）]-1），判斷動(dòng)物出現(xiàn)胰島素抵抗后，尾靜脈注射1%鏈脲佐菌素（STZ）30 mg/kg，1周后檢測血糖，隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L，視為糖尿病造模成功，選取120只造模成功大鼠按照血糖和體質(zhì)量分層隨機(jī)分為糖尿病對(duì)照組、凡士林組、生肌象皮膏組。4組動(dòng)物均以水合氯醛腹腔麻醉后，背部剃毛，常規(guī)消毒，用打孔器于大鼠背部脊柱左側(cè)打孔（φ2 cm），潰瘍深及筋膜層，止血后以無菌紗布包扎，自由飲水與喂食。3 d后潰瘍創(chuàng)面有肉芽組織開始生長，潰瘍模型制備成功。

2.2 治療方法 4組大鼠單籠喂養(yǎng)，均每日換藥1次，祛除創(chuàng)面上硬痂，常規(guī)消毒，用生理鹽水沖洗創(chuàng)面。生肌象皮膏組外用生肌象皮膏紗條外敷，凡士林組用凡士林紗條外敷，空白組、糖尿病對(duì)照組均以生理鹽水紗條外敷。4組動(dòng)物均自由飲水、進(jìn)食，創(chuàng)面外用無菌紗布包扎，固定。

2.3 取材方法 分別于1、7、14、21 d每組處死動(dòng)物10只，手術(shù)取新鮮肉芽組織共160份，于液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 實(shí)驗(yàn)方法 利用反轉(zhuǎn)錄酶ExScript RTase將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板利用ES Taq HS進(jìn)行Real Time PCR擴(kuò)增反應(yīng)

3 結(jié)果

見表1-2。

表1 各組時(shí)間段IGF-1值（±s，n=10）Tab.1 Value of IGF-1 of each day in every group（±s，n=10）

表1 各組時(shí)間段IGF-1值（±s，n=10）Tab.1 Value of IGF-1 of each day in every group（±s，n=10）

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；其余3組組間比較無差異。

組別 第1天 第7天 第14天 第21天生肌象皮膏組 1.18±0.371.56±0.48*2.09±0.545*0.14±0.04**凡士林組 1.12±0.232.51±0.36*3.34±1.600*0.13±0.02**糖尿病對(duì)照組 1.21±0.472.23±0.55*2.89±1.370*0.15±0.05**空白組 1.27±0.371.33±0.29*1.25±1.250*1.27±0.36**

表2 各組時(shí)間段IGF-1R值（±s，n=10）Tab.2 Value of IGF-1R of each day in every group（±s，n=10）

表2 各組時(shí)間段IGF-1R值（±s，n=10）Tab.2 Value of IGF-1R of each day in every group（±s，n=10）

注：與糖尿病對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與凡士林組比較，△P<0.05。

組別 第1天 第7天 第14天 第21天生肌象皮膏組 0.94±0.130.82±0.24* 0.77±0.12*△ 0.61±0.11*△凡士林組 0.89±0.180.61±0.220.49±0.180.32±0.08糖尿病對(duì)照組 0.97±0.300.56±0.150.40±0.110.33±0.05空白組 0.95±0.111.12±0.17**0.98±0.19**1.02±0.18**

4 討論

IGF-1與胰島素原高度同源，是有促細(xì)胞分化和增殖活性，幾乎所有組織和細(xì)胞都能分泌，其生物學(xué)功能還可通過自分泌和旁分泌來實(shí)現(xiàn)[4]。IGF-1通過激活磷脂酰肌醇信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化，加速傷口愈合；同時(shí)能夠誘導(dǎo)堿性成纖維細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β等其他細(xì)胞因子表達(dá)，促進(jìn)纖維粘連蛋白、聚葡萄糖胺和膠原等胞外基質(zhì)的合成和分泌，影響創(chuàng)面修復(fù)后組織的改建。而IGF-1的大部分細(xì)胞效應(yīng)是通過胰島素樣生長因子-1受體（IGF－1R）實(shí)現(xiàn)，因此，IGF-1R 的表達(dá)增強(qiáng)可以揭示IGF-1生物作用的增強(qiáng)[5]。

IGF-1與其受體特異性結(jié)合后引起的信號(hào)通路不僅參與調(diào)控細(xì)胞增殖和分化，而且還能夠抑制細(xì)胞趨向凋亡。IGF-1激活受體后，將胞外信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，通過P38MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)P53蛋白及其下游分子P21降解，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在潰瘍組織中IGF-1R表達(dá)較低，引起其抗凋亡的活性減弱，使得處于低氧和缺乏營養(yǎng)環(huán)境中的組織修復(fù)細(xì)胞大量凋亡，最終導(dǎo)致肉芽組織生長緩慢，數(shù)量減少，傷口愈合延遲。因此潰瘍組織內(nèi)IGF-1R蛋白低表達(dá)可能是創(chuàng)面修復(fù)細(xì)胞趨向凋亡，傷口愈合遲緩形成潰瘍的原因之一[6-7]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病各組動(dòng)物的IGF-1在潰瘍?cè)缙诔矢咚奖磉_(dá)，而在晚期呈現(xiàn)低水平表達(dá)?？赡苡捎谝葝u素樣生長因子與胰島素同源，糖尿病血中胰島素低水平狀態(tài)刺激周圍組織細(xì)胞分泌與胰島素同源的IGF-1。而糖尿病潰瘍后期IGF-1含量低水平表達(dá)，可能由于終末糖基化產(chǎn)物的大量堆積，嚴(yán)重的抑制組織、細(xì)胞的功能，使對(duì)胰島素樣生長因子的分泌減少。同時(shí)潰瘍后期細(xì)胞增殖的減慢和細(xì)胞凋亡的加快，細(xì)胞的數(shù)量、活性下降，周圍組織、細(xì)胞對(duì)胰島素樣生長因子的分泌量下降而導(dǎo)致IGF-1的含量降低。IGF-1的大部分細(xì)胞效應(yīng)是通過IGF-1R實(shí)現(xiàn)，在本實(shí)驗(yàn)中IGF-1R的蛋白含量在糖尿病大鼠創(chuàng)面肉芽組織中呈低水平表達(dá)，隨著潰瘍時(shí)間延長呈遞減趨勢(shì)，這可能由于高血糖引起糖基化產(chǎn)物蓄積導(dǎo)致細(xì)胞功能下降分泌IGF-1R下降，即使在糖尿病潰瘍?cè)缙贗GF-1的高水平表達(dá)但不能充分與IGF-1R結(jié)合而不能發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化的生理功能。同時(shí)由于IGF-1R的低表達(dá)，引起抗凋亡的活性減弱，使組織修復(fù)細(xì)胞大量凋亡，導(dǎo)致肉芽組織生長緩慢。這與糖尿病創(chuàng)面愈合時(shí)間延長相一致。因此糖尿病創(chuàng)面修復(fù)遲緩可能由于胰島素樣生長因子受體的減少和晚期胰島素樣生長因子分泌的減少有關(guān)。

生肌象皮膏組IGF-1蛋白含量7 d分泌增加，第14天達(dá)到高峰與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但有升高的趨勢(shì)。在21 d IGF-1的含量明顯低于空白組。IGF-1R的含量在各時(shí)間段均低于空白組，呈遞減趨勢(shì)。與糖尿病對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IGF-1有促進(jìn)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化，誘導(dǎo)堿性成纖維細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β等其他細(xì)胞因子表達(dá)，促進(jìn)纖維粘連蛋白、聚葡萄糖胺和膠原等胞外基質(zhì)的合成和分泌的作用。糖尿病各組IGF-1的含量高于空白組，但由于糖尿病導(dǎo)致的IGF-1R的下降，以致IGF-1的作用不能有效發(fā)揮。生肌象皮膏可以增加糖尿病創(chuàng)面肉芽組織中IGF-1R的含量而發(fā)揮IGF-1的功能而促進(jìn)肉芽組織的生長。說明生肌象皮膏不能促進(jìn)胰島素樣生長因子的分泌，卻能增加胰島素樣生長因子受體的含量而抑制細(xì)胞凋亡，而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

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