李 巖，程素利，周 震，焦召華，陳 爽

（1.天津市公安醫(yī)院，天津 300042；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300150）

脊髓損傷（SCI）是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，因中斷了通過損傷區(qū)的神經(jīng)元軸突，導(dǎo)致?lián)p傷節(jié)段以下癱瘓、感覺缺失及自主神經(jīng)障礙，在身體、心理及經(jīng)濟上給個人和社會造成很大負擔(dān)[1]。臨床上，火針對SCI后功能恢復(fù)具有一定治療作用[2]，為探討其產(chǎn)生療效的可能作用機制，本課題組就火針對實驗性SCI大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）蛋白表達及運動功能的影響進行相關(guān)研究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組及動物模型制備 選擇健康SD大鼠60只（雌雄不拘），體質(zhì)量250～300 g（由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2007-0001）；所有大鼠均在標(biāo)準(zhǔn)條件下統(tǒng)一喂養(yǎng)。

1.1.1 動物分組 采用隨機對照研究方法，按抓出順序編號并采用隨機數(shù)字表分為假手術(shù)組，模型組，火針干預(yù)組，每組又分為 1 d，3 d，5 d，7 d，4 個時相，每個時相各5只大鼠（時相的選擇根據(jù)相關(guān)國內(nèi)外文獻確定[3]）。

1.1.2 動物模型制備 急性SCI動物模型建立采用改良的Allen’s法[4]。即采用20 g/L戊巴比妥鈉（40 mg/kg體質(zhì)量）腹腔注射麻醉，取后正中切口，切除T9棘突、部分T10棘突和部分椎板，暴露硬膜，質(zhì)量為10 g的鐵錘從25 mm高處自由落下，撞擊硬膜囊，撞擊能量為25 mm×10 g，損傷直徑為2.5 mm。與脊髓接觸的撞桿底端呈弧狀凹陷，直徑2.5 mm，與脊髓表面相吻合。撞擊成功的標(biāo)志為大鼠尾巴痙攣性擺動，雙下肢及身體回縮樣撲動，雙下肢呈弛緩性癱瘓。假手術(shù)組只做T9-T10椎板切除術(shù)。術(shù)后小心護理飼養(yǎng)，每天擠壓排尿3次，直到反射性膀胱排空建立。

1.2 治療方法

1.2.1 穴位選取 根據(jù)“經(jīng)脈所過，主治所及”針刺原則，參照中國針灸學(xué)會實驗針灸分會制定的《動物針灸穴位圖譜》及《實驗針灸學(xué)》選取穴位。取大鼠脊髓損傷部位上下端的棘突間隙，相當(dāng)于T7、T8及T11、T12部位，各旁開0.5 cm，共4個穴，8個針刺點。

1.2.2 操作方法 火針組：選擇所刺穴位，體位固定，充分消毒后，左手持酒精燈于胸前，盡量接近針刺的部位；右手拇、食指、中指微屈夾持針柄，針尖方向指向欲刺部位，置火針于酒精燈火焰的外上1/3（即外焰）處，先加熱針體，再加熱針尖，要求加熱至通紅，然后施針于患處。采用快針法，每穴僅刺1次，深度為3～5 mm。造模后即行針刺1次，之后每隔24 h針刺1次。

1.3 行為學(xué)評分 行為學(xué)評分采用BBB法[5]對各組不同時相動物進行行為功能評分。

1.4 BDNF免疫組織化學(xué)染色

1.4.1 取材 行為學(xué)評分后處死動物，采用灌注法取材，即0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）溶液，YZ9901型恒流泵60 mL/min持續(xù)6 min，快速沖洗血管床，可見肝臟發(fā)白，為灌注正確。4%多聚甲醛溶液，YZ9901型恒流泵40 mL/min持續(xù)8 min，身體逐漸僵硬顏色變白為止。小心剪開大鼠脊柱，注意保持脊髓的完整，以脊髓損傷區(qū)為中心取出長約1 cm脊髓段，將取下的標(biāo)本放入新鮮固定液（4℃）固定，備做石蠟切片。

1.4.2 免疫組化SABC法檢測 二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水；自來水和蒸餾水各洗5 min；0.3%H2O2的甲醇溶液室溫孵育10 min；蒸餾水洗5 min，0.01 mol/L PBS浸泡5 min；0.5%Triton x-100浸泡10 min，增加組織通透性；0.01 mol/L PBS 沖洗，5 min×3 次；滴加即用型復(fù)合消化酶，37℃恒溫水浴20 min；0.01 mol/L PBS沖洗，5 min×3次；10%正常山羊血清封閉，真空25℃孵育10 min；滴加適量一抗工作液（1∶100 BDNF抗體）在濕盒4℃放置48 h；室溫放置1 h，0.01 mol/L PBS沖洗，5 min×3次；滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液（1∶100，山羊抗兔 IgG），真空 25℃孵育 10 min；0.01mol/LPBS沖洗，5min×3次；滴加適量的SP-HRP（1∶100），真空 25℃孵育 10 min；0.01 mol/L PBS 沖洗，5 min×3次；DAB室溫顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時間；自來水充分沖洗；蘇木素輕度復(fù)染；再經(jīng)梯度乙醇和二甲苯脫水，透明；中性樹脂膠封片。

1.4.3 免疫組化結(jié)果判定 以PBS代替一抗作陰性對照，胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為BDNF陽性。

2 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS18.5統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果與分析

3.1 各組大鼠BBB評分比較 手術(shù)后，模型大鼠雙后肢運動功能無明顯變化，僅個別動物可出現(xiàn)1個或2個關(guān)節(jié)的輕微運動，BBB評分均為0～1分，隨后BBB評分逐漸上升。1周后，火針治療組與模型組比較，顯示出一定的差異。采用火針治療后，可促進大鼠后肢運動功能的恢復(fù)，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。各組大鼠1周內(nèi)BBB評分情況比較，結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠一周內(nèi)BBB評分情況比較（±s）Tab.1 Comparison of the BBB scores of rats in each group in a week（±s）分

表1 各組大鼠一周內(nèi)BBB評分情況比較（±s）Tab.1 Comparison of the BBB scores of rats in each group in a week（±s）分

注：與模型組比較，*P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組火針組n 2020201 d 3 d 5 d 7 d 20.00±1.0020.00±1.0020.00±1.0020.00±1.0000.97±0.0501.25±0.0602.00±0.1002.50±0.1201.22±0.0602.44±0.1202.75±0.14004.13±0.21*

3.2 各組大鼠BDNF表達情況比較 采用光鏡在×50、×100、×200、×400 等不同倍數(shù)下整體瀏覽切片后，×200采集圖片，BDNF圖像分析采用美國Media Cybernetics公司Image-Pro Plus圖像分析軟件測定各組標(biāo)本陽性神經(jīng)元細胞的個數(shù)。結(jié)果顯示，假手術(shù)組各時間點BDNF均有少量表達，火針組和模型組在傷后BDNF陽性神經(jīng)元數(shù)逐漸增加，3 d、5 d、7 d時相火針組與模型組相比均具有明顯差異（P<0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各實驗組BDNF陽性運動神經(jīng)元計數(shù)比較（±s）Tab.2 Comparison of the counts of BDNF positive motor neurons in each group（±s）分

表2 各實驗組BDNF陽性運動神經(jīng)元計數(shù)比較（±s）Tab.2 Comparison of the counts of BDNF positive motor neurons in each group（±s）分

注：與模型組比較，*P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組火針組n 2020201 d 3 d 5 d 7 d 16.2±1.0716.0±0.7116.8±1.07* 16.8±0.68☆19.6±1.2920.8±1.1626.0±1.87☆ 28.2±0.73☆21.0±1.1027.8±1.39* 29.4±1.29* 34.4±1.08*

3.3 BBB與BDNF相關(guān)性分析 對火針組大鼠BBB評分及BDNF陽性神經(jīng)元計數(shù)進行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r=0.991，回歸方程為Y（BBB）=-3.393+0.214X（BDNF），表明兩者呈高度正相關(guān)。

4 討論

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF在中樞神經(jīng)損傷后再生修復(fù)和防止神經(jīng)細胞退行性變等多方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，火針能增加SCI大鼠脊髓BDNF的表達，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明火針具有保護運動神經(jīng)元，減輕變性壞死的作用；火針組的各時間點BBB評分均高于模型組，特別是在造模并干預(yù)7 d后效果更加顯著（P＜0.05），且與BDNF表達呈高度正相關(guān)，說明火針具有促進SCI后大鼠運動功能的恢復(fù)，其作用機制與促進BDNF表達有關(guān)。

近幾年，國內(nèi)外對SCI治療的研究多集中在具有自我復(fù)制和多向分化潛能的神經(jīng)干細胞（NSCs）上，外源性NSCs移植已在臨床得到初步應(yīng)用[7]。但外源性NSCs移植存在體內(nèi)排異及倫理學(xué)的障礙，因此誘導(dǎo)內(nèi)源性NSCs增殖并分化為神經(jīng)元細胞，進而參與神經(jīng)修復(fù)越來越被廣泛關(guān)注[8]。但是，也有研究顯示，SCI后誘導(dǎo)的內(nèi)源性NSCs最終大多分化為星形膠質(zhì)細胞，并參與了疤痕的產(chǎn)生，形成組織屏障，進而阻礙脊髓神經(jīng)通路的重建[9]。因此如何誘導(dǎo)NSCs定向分化為神經(jīng)元細胞是目前應(yīng)用內(nèi)源性NSCs治療SCI的難點和熱點。有研究已經(jīng)證實，BDNF能促進NSCs增殖[10]，并能誘導(dǎo)其分化為成熟神經(jīng)元細胞，促進其突起生長[11]。同時，有學(xué)者進行了離體狀態(tài)下BDNF對人脊髓NSCs增殖分化影響的研究，發(fā)現(xiàn)BDNF抗體封閉組神經(jīng)球及神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，證實了BDNF能促進NSCs增殖并向神經(jīng)元分化[12]。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，火針可通過促進BDNF表達，從而對SCI發(fā)揮神經(jīng)保護作用。那么，在此基礎(chǔ)上，火針是否同時具有神經(jīng)修復(fù)作用呢？結(jié)果尚未可知。但大量文獻已證實BDNF可促進NSCs增殖并向神經(jīng)元分化，產(chǎn)生神經(jīng)修復(fù)作用。因此，可初步推斷火針可能會通過激活并增加BDNF表達，進而對NSCs產(chǎn)生一定的影響，但具體機制及效應(yīng)如何，尚需進一步研究。

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