舒莉萍，何志旭，姚冬靜，馬健娟，李 濤，葉芝旭

(貴陽醫(yī)學院，1.組織工程與干細胞實驗中心，2.免疫教研室，3.兒科教研室，貴州貴陽 550004)

hoxd3基因是血管形成和發(fā)育的關鍵基因，其在血管內皮細胞逐漸遷移形成血管的過程中發(fā)揮了重要的作用［1］，而且其與軀干的形成以及正常形態(tài)的維持有關［2］。目前雖然對hoxd3基因的作用機制尚不明確，但是，已有研究表明其在細胞的黏附作用中可能起調控作用［3］。

本研究采用新型模式生物斑馬魚，通過構建并鑒定pCS2+-hoxd3重組質粒，體外轉錄表達hoxd3基因反義mRNA探針，并運用斑馬魚全胚胎原位雜交技術檢測了斑馬魚hoxd3基因在野生型斑馬魚發(fā)育過程中的表達情況，從三維立體視角來研究在血管形成以及發(fā)育過程中hoxd3基因的表達和可能的作用，為進一步研究hoxd3基因在斑馬魚血管形成和發(fā)育過程中的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 野生型斑馬魚成魚Tuebingen魚系，由上海生命科學院健康研究所劉廷析研究員饋贈，本實驗室繁殖培育。養(yǎng)殖條件:(28±2)℃帶有過濾系統(tǒng)的循環(huán)水系統(tǒng)養(yǎng)殖，12 h/d光照。

1.1.2 實驗試劑 PCR引物由北京諾賽生物科技有限公司合成;E.coli DH5α由本課題組保存，pCS2+質粒載體由上海生命科學院健康研究所劉廷析研究院饋贈，Trizol試劑、逆轉錄試劑First-strand plus購自Invitrogen公司，高保真KOD-Plus PCR酶購自TOYOBO公司，限制性內切酶EcoRⅠ和XbaⅠ、T4 DNA連接酶以及DNA Marker均購自Fermentas公司，質粒小抽試劑盒購自于Axygen公司。DNA凝膠回收試劑盒購自上海申能生物公司，地高辛RNA標記和檢測試劑盒以及NucAwayTMSpin Columns購自Ambion公司，BCIP/NBT購自VECTORLab。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA的提取 收集受精后(0.75～72)小時(hours post-fertilization，hpf)多個時相的Tuebingen野生型斑馬魚胚胎，脫卵膜后置于1.5 ml的Epp管中，加入1 ml Trizol充分勻漿處理，室溫靜置5 min，經氯仿、異丙醇、75%乙醇洗滌、沉淀、晾干后，加入適量DEPC水溶解，-70℃保存。

1.2.2 RT-PCR克隆hoxd3基因 將提取的總RNA，利用SuperScriptTMⅢ First-Strand Systhesis System kit的隨機引物進行反轉錄，反應在AG22331型熱循環(huán)儀(eppendorf公司)上按kit操作步驟進行。根據斑馬魚 hoxd3基因的mRNA 序列(NM_131125.1)，引入 EcoRⅠ、XbaⅠ酶切位點以及保護堿基設計引物。上游引物Pl:5'-CGGAATTCACCTGCGATGACAAGAGTCC-3'，下游引物P2:5'-GCTCTAGAACTCTGTTCCC GGGTACCTT-3'。以逆轉錄得到的cDNA為模板，進行hoxd3的RT-PCR擴增，擴增條件為:cDNA 合成 40℃ 30 min，94℃ 預變性 2 min，94℃變性30 s;55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30次循環(huán)，最后延伸72℃ 10 min，PCR產物大小為450 bp，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 PCR產物的克隆 將 pCS2+質粒利用鈣轉法轉入E.coli DH5α感受態(tài)菌中，通過氨芐抗性篩選出陽性克隆，擴增后運用堿裂解法提取pCS2+質粒DNA后，用EcoRⅠ和 XbaⅠ雙酶切，1%瓊脂糖電泳后割膠回收。將hoxd3基因的PCR產物用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收，將回收產物與上述得到的經EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切的pCS2+質粒在T4酶的作用下相連接，將連接產物運用鈣轉法轉入E.coli DH5α感受態(tài)菌中，經氨芐抗性篩選出陽性克隆并擴增后，運用堿裂解法提取pCS2+-HoxD3重組質粒。

1.2.4 pCS2+-hoxd3重組質粒鑒定和測序 鑒定pCS2+-hoxd3重組質粒:①雙酶切鑒定:用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切pCS2+-hoxd3重組質粒，通過1%瓊脂糖凝膠電泳判斷酶切產物大小;②菌落RT-PCR鑒定pCS2+-hoxd3重組質粒，通過1%瓊脂糖凝膠電泳判斷擴增產物大小;③序列測定鑒定:將重組質粒送至北京諾賽生物技術公司進行序列測定。

1.2.5 地高辛標記的hoxd3反義mRNA探針制備 將pCS2+-hoxd3重組質粒用EcoRⅠ進行單酶切，經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用DNA純化試劑盒割膠回收得到線性化的pCS2+-hoxd3重組質粒。利用T3體外轉錄體系，以線性化的pCS2+-hoxd3重組質粒DNA為模板，以地高辛標記的寡核苷酸為原料，經體外轉錄得到地高辛標記的hoxd3反義mRNA探針后，用NucAwayTMSpin Columns純化吸附柱回收hoxd3反義mRNA探針，經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 斑馬魚全胚胎原位雜交 選取Tuebingen野生型斑馬魚0.75～72 hpf的不同時間點胚胎進行全胚胎原位雜交，用1×PBST溶液洗去固定液，用甲醇進行梯度脫水后，將胚胎置于68℃雜交爐中進行預雜交1 h，加入制備好的地高辛標記的hoxd3反義mRNA探針，于68℃雜交爐中過夜，用不同濃度的SSCT將多余的探針洗去，加入地高辛抗體后過夜，用MABT將多余的抗體洗掉，加入BCIP∕NBT染液對雜交胚胎進行染色，在體視顯微鏡下觀察并記錄結果后，用固定液對雜交胚胎進行再固定并且照相。

2 結果

2.1 hoxd3基因RT-PCR結果 在圖1中可見到一特異性擴增帶，位于200 bp～500 bp，大小與預期的450 bp相符。

圖1 hoxd3基因RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.1 RT-PCR product analysis of hoxd3 gene

2.2 pCS2+-hoxd3重組質粒酶切鑒定結果 將篩選過的陽性重組質粒通過EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定，將酶切產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳。圖2顯示，用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切得到的hoxd3基因片段大小約450 bp，與RT-PCR產物大小一致;另外，得到的另一個DNA片段大小約4 100 bp，與pCS2+質粒EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切后產物大小一致。

2.3 pCS2+-hoxd3重組質粒菌落RT-PCR鑒定結果 將篩選過的陽性重組質粒作為模板進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在圖3中可見到一特異性擴增帶，位于200 bp～500 bp之間，大小與預期的450 bp相符。

2.4 pCS2+-hoxd3重組質粒測序結果 將篩選過的陽性重組質粒經北京諾賽生物有限公司測序，結果經Genbank檢索發(fā)現與hoxd3基因完全一致(圖4)。

2.5 斑馬魚全胚胎原位雜交結果 在Tuebingen野生型斑馬魚24 hpf～72 hpf胚胎的中腦后腦交界處以及后腦中(紅色箭頭所示)可以觀察到hoxd3基因的藍黑色陽性雜交信號(圖5);在36 hpf至72 hpf的斑馬魚胚胎中，可以觀察到前腦(黃色箭頭所示)、中腦(紅色箭頭所示)都有hoxd3基因明顯的藍黑色雜交信號;在脊索(藍色箭頭所示)部位，則是從18 hpf開始出現，36 hpf達到高峰，而至48 hpf及其以后的胚胎脊索組織中則幾乎觀察不到hoxd3基因的表達。由此可見，hoxd3基因在Tuebingen野生型斑馬魚神經系統(tǒng)中是高表達的。

3 討論

本研究采用新興模式生物斑馬魚作為實驗動物，實驗顯示其體外受精，胚胎體外發(fā)育且通體透明，便于活體觀察和研究［4］，這些優(yōu)點為本研究早期血管的形成和發(fā)生，以及早期的生長發(fā)育提供很好的基礎。

圖5 hoxd3基因Tuebingen野生型斑馬魚中全胚胎原位雜交結果Fig.5 Whole-mount in situ hybridization with hoxd3 in zebrafish embryos at different hours postfertilization

全胚胎原位雜交技術(whole mount in situ hybridization，WISH)可以從整體水平反映胚胎發(fā)育過程中基因表達的時空順序，常被廣泛應用于胚胎發(fā)育調控基因表達的研究。該技術簡單易行，地高辛所標記的探針具有較高靈敏度，本實驗通過設計斑馬魚hoxd3基因的引物，提取斑馬魚胚胎總RNA，成功擴增出hoxd3基因片段，將擴增出來的hoxd3基因片段通過T4連接酶與載體pCS2+質粒進行定向重組，得到pCS2+-hoxd3重組質粒，經過雙酶切、菌落PCR以及序列測定鑒定pCS2+-hoxd3重組質粒構建成功，并在此基礎上以pCS2+-hoxd3重組質粒為模板進行體外轉錄，得到了片段為200 bp到500 bp之間的地高辛標記的hoxd3反義mRNA探針，并經斑馬魚全胚胎原位雜交技術檢測了hoxd3反義mRNA探針在Tuebingen野生型斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程中的表達情況。

Hox基因家族最初是由Mcginnis等［3］人在果蠅中發(fā)現，是一類與正常胚胎發(fā)育密切相關的主要調控基因［5］，目前已有研究表明，hoxd3基因在細胞的黏附作用中可能有一定的作用［3］，而在細胞、組織及器官的形態(tài)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，若hoxd3基因缺失將會導致嚴重的肢體以及生殖器官的形態(tài)異常［4-6］。本研究證實了hoxd3基因在斑馬魚胚胎的后腦中有明顯表達，并首次發(fā)現在脊索中也有明顯的表達;在斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程中，hoxd3基因在神經系統(tǒng)的表達十分明顯，這說明hoxd3基因與神經系統(tǒng)的發(fā)育以及體節(jié)的形成是相關的，證實hoxd3基因在組織器官發(fā)育過程中可能發(fā)揮著重要作用，但其可能的分子機制有待進一步研究。

目前研究表明，Hox基因與胚胎發(fā)育過程中的血管形成有著很重要的關系［1，7］，其中，hoxd3基因作為Hox基因家族的一員，在血管形成以及發(fā)育過程中其是通過影響血管內皮細胞逐漸遷移形成新生的血管而發(fā)揮作用的，而且hoxd3基因的持續(xù)表達可以使靜止的內皮細胞被激活，從而刺激新生血管的形成［1，8-9］。但是，hoxd3基因在血管形成以及發(fā)育過程中確切的生物學作用及其分子機制至今尚不是很清楚。本研究在斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程中未檢測到hoxd3基因在血管生成區(qū)域的表達，這一結果與在人、老鼠以及其它物種中的研究結果并不完全吻合，而全胚胎原位雜交技術是依靠肉眼觀察來分辨基因表達差別的方法，若hoxd3基因在血管生成區(qū)域的表達量很低，那使用WISH技術就很難檢測到hoxd3基因在血管生成區(qū)域的表達，若采用實時熒光定量的PCR方法可解決這一問題。

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