廖 立，楊小紅，金 巖

(1.第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院口腔組織病理學教研室，組織工程研發(fā)中心，陜西西安 710032;2.遵義醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院口腔修復科，貴州遵義 563003)

雌激素、糖皮質激素等全身性內分泌激素能夠影響骨骼的改建。在絕經(jīng)期后女性超過50%患有不同程度的骨質疏松［1］。骨質疏松的發(fā)生現(xiàn)在認同的觀點是在骨改建過程中成骨功能與破骨功能的失調所致。雌激素缺乏不僅能夠激活輔助 T細胞(T helper，Th)，而且能通過RANK/RANKL等途徑促進破骨前體細胞向破骨細胞的轉化，增強破骨功能［2］;同時，雌激素缺乏也能夠抑制成骨相關細胞的增殖和分化。有研究認為，骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMMSC)是成骨前體細胞的來源，具有雌激素受體，可以受到雌激素的直接作用，影響增殖和分化相關基因表達;雌激素缺乏還可以活化輔助性T細胞，通過Fas/FasL信號途徑間接導致BMMSC的凋亡［3］。但是，相比于對破骨細胞的作用而言，此激素缺乏對于成骨相關細胞的作用機制仍不確定。

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢切除(ovariectomy，OVX)小鼠骨質疏松模型中BMMSC的分化能力發(fā)生了一定的改變。與假手術(sham surgery，Sham)小鼠相比，OVX小鼠BMMSC成骨分化能力減弱，而成脂分化能力增強，其細胞行為的改變與小鼠骨骼的病理表現(xiàn)相一致，提示BMMSC的功能異常在骨質疏松的發(fā)生中發(fā)揮了重要的作用。部分研究也支持此假設［4-5］。同時，還發(fā)現(xiàn) OVX小鼠 BMMSC雖然在體外培養(yǎng)過程中使用了含雌激素的普通胎牛血清和培養(yǎng)基，但其分化功能卻仍存在缺陷，這說明雌激素不僅通過外源性信號即時調控BMMSC的功能，雌激素長時間的缺乏還能對BMMSC造成內源性的損傷，且這種損傷在雌激素水平恢復至正常之后一定時期內是無法完全恢復的。這與近年報道的雌激素缺乏后對乳腺干細胞造成的增殖能力損傷相類似［6-7］。然而，對于雌激素缺乏如何導致BMMSC功能異常的分子機制目前尚不明確。

近年來，microRNA逐漸成為研究的熱點，大量研究發(fā)現(xiàn)，其作為一種保守而普遍的調控機制，在細胞增殖、分化、凋亡、信號轉導等生命過程中均發(fā)揮著重要的作用［8-10］。細胞microRNA表達譜的改變將對干細胞的狀態(tài)和功能造成顯著的影響［11-12］。已有研究發(fā)現(xiàn)，多種microRNA在BMMSC的分化過程中發(fā)揮著重要的調控作用［13-15］。所以，本研究假設在雌激素缺乏的條件下，可能導致 BMMSC內部microRNA表達譜發(fā)生一定的改變，并通過調控分化相關靶基因而影響了BMMSC的正常分化，損害正常的成骨功能而導致或加速骨質疏松的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 OVX小鼠骨質疏松模型的建立 C57BL/6J近交系小鼠由第四軍醫(yī)大學動物實驗中心購買。取30只8周齡小鼠，隨機分為2組，以1%戊巴比妥鈉麻醉后，從背部開口尋找到雙側卵巢，卵巢切除組(OVX)于子宮頸部結扎后切除卵巢，縫合傷口;假手術組(Sham)僅切除部分脂肪組織，保留卵巢，縫合傷口。置于SPF級動物房飼養(yǎng)3個月后，進行股骨micro CT和組織學檢測，驗證模型是否建立成功。

1.2 BMMSC體外培養(yǎng) C57BL/6J小鼠頸椎脫臼后剝取股骨及脛骨，剔除表面肌肉及軟組織，以1 ml針管沖洗骨髓后將細胞懸液接種于含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的α-MEM培養(yǎng)基內，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。每2天半量換液，當細胞密度達到80%后以2×104/cm2的密度傳代。

1.3 microRNA芯片篩選 取術后3個月OVX組及sham組小鼠各9只，分別分離股骨及脛骨后按上述方法常規(guī)培養(yǎng)BMMSC，待原代細胞密度達到80%后，使用細胞裂解液(LC公司)提取RNA行microRNA微陣列芯片檢測(LC-μParafloTM微流體芯片，杭州聯(lián)川生物信息技術有限公司)。

1.4 BMMSC的成骨成脂誘導 成骨成脂誘導及檢測:成脂誘導液為α-MEM，加入10%胎牛血清(杭州四季青)，0.5 mmol/L異丁基甲基黃嘌呤(IBMX;Sigma)，2 μmol/L 胰島素(Sigma)和10 nmol/L地塞米松(Sigma)。成骨誘導液為α-MEM，加入10%胎牛血清(杭州四季青)，100 nmol/L地塞米松，5 mmol/L甘油磷酸鈉和50 μg/ml左旋維生素C(Sigma)。細胞按照2×105/孔接種于6孔板內，待密度達到90%以后加入成脂誘導液和成骨誘導液進行培養(yǎng)。加入誘導液后分別于第1天、第7天和第14天以TRIZOL@Reagent(Invitrogen)提取 RNA。同時，分別對成骨及成脂誘導14 d后的BMMSC進行茜素紅、油紅染色及相關基因(ALP、OCN、RUNX2、PPAR-γ、LPL)進行 RT-PCR 檢測，驗證成骨成脂誘導是否成功。

1.5 RT-PCR檢測 按照產(chǎn)品使用說明書，使用RT-PCR試劑盒(寶生物工程有限公司，Takara)對所提取RNA進行逆轉錄反應并用ABI7500 RT-PCR儀進行檢測。其中microRNA RT-PCR引物由廣州銳博生物科技有限公司訂制，其余mRNA RT-PCR引物由上海英濰捷基生物技術有限公司合成。

2 結果

2.1 骨質疏松小鼠BMMSC的microRNA表達譜發(fā)生了改變 通過對體外培養(yǎng)的原代小鼠BMMSC進行 microRNA芯片篩查，發(fā)現(xiàn)在mirBase 16.0 數(shù)據(jù)庫(www.mirbase.org)中已發(fā)現(xiàn)的1032 microRNA中，有305種在BMMSC中表達。其中，第一組芯片中差異性表達的microRNA有34個，第二組芯片中差異性表達的microRNA有95個，第三組芯片中差異性表達的 microRNA有89個。但是，三組芯片中microRNA的差異并非完全一致，通過統(tǒng)計學分析，共有10個microRNA差異明顯(表1)。根據(jù)文獻報道及三組芯片的一致性，選擇了5個microRNA進行RT-PCR檢測，對芯片結果進行驗證，RT-PCR結果與芯片結果基本一致，證明了芯片篩查結果的可靠性及可重復性(圖1)。

表1 芯片篩查差異性表達microRNATable 1 The microRNA differentially expressed in micro-array chip

圖1 Sham組及OVX組BMMSC中microRNA表達水平Fig.1 The results of microRNA expression level of BMMSCs of Sham group and OVX group

2.2 部分差異性表達microRNA與BMMSC成骨分化過程密切相關 對BMMSC進行成骨分化誘導實驗，從不同時間點采集細胞RNA樣本。誘導14 d后，通過茜素紅染色和RUNX2、ALP、OCN、COL-1基因表達及RT-PCR檢測證明成骨誘導實驗確實成功(結果未展示)。對不同時間點樣本進行RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)成骨誘導對部分篩選出的microRNA的表達產(chǎn)生了明顯的影響(表 2)。其中，miR-20a、miR-21、miR-29a、let-7a在成骨過程中均呈逐漸下降趨勢，成骨誘導14 d后，miR-29a降至誘導前水平的20%左右，miR-20a和let-7a降至原有水平的10%以下，miR-21在誘導第1天后出現(xiàn)一定的上升，隨后下降至誘導前水平的60%;而miR-680在成骨分化中呈上升趨勢，誘導14 d后較誘導前上升了約12倍。這些結果表明，上述microRNA與成骨分化過程密切相關，可能對分化中關鍵靶基因發(fā)揮了調節(jié)作用，影響B(tài)MMSC的定向分化。但是，其變化趨勢與前期實驗觀測到的骨質疏松BMMSC的成骨能力下降不完全一致。

2.3 部分差異性表達microRNA與BMMSC成脂分化密切相關 對BMMSC進行成脂分化誘導，從不同時間點采集細胞RNA樣本。誘導14 d后，通過油紅染色和PPAR-γ、LPL基因表達，以及RT-PCR檢測，證明成脂誘導實驗確實成功(結果未展示)。對不同時間點樣本進行RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)其中3個microRNA的表達在成脂誘導過程中發(fā)生了明顯變化(表3)。其中，miR-680在成脂過程中明顯上升，第14天時升高了約8倍。而miR-20a在成脂過程中呈持續(xù)性下降去勢，在誘導7 d后基本沒有表達，降至原有水平的1%以下。miR-29a于成脂誘導1 d時出現(xiàn)了一定程度的上調，但隨后明顯下調至原水平的10%左右。而miR-21和let-7a在不同樣本成脂誘導的重復實驗中表達不穩(wěn)定，趨勢不明確(結果未展示)。這些結果均說明上述microRNA與BMMSC成脂過程密切相關，且其變化趨勢與前期試驗觀測到的骨質疏松BMMSC的成脂功能增強相一致。

表2 成骨誘導過程中BMMSC的microRNA表達變化Table 2 The expression of microRNA in BMMSC during osteogenesis induction

表3 成脂誘導過程中BMMSC的microRNA表達變化Table 3 The expression of microRNA in BMMSC during adipogenesis induction

3 討論

本研究首次對雌激素缺乏所致骨質疏松BMMSC的microRNA表達譜進行微陣列芯片篩查，發(fā)現(xiàn)在骨質疏松下BMMSC microRNA表達譜發(fā)生了一定的改變。首先，特定的microRNA僅在特定的細胞內表達，在1 032種已知的小鼠microRNA中僅有305種在BMMSC中表達，且表達的豐度在不同來源BMMSC中相對一致，證明microRNA可以作為細胞的身份標識［16］;同時，在芯片篩選結果中，多數(shù)microRNA的表達量改變不大，這與近期一些針對BMMSC進行的microRNA芯片篩選結果類似［17-18］。這可能是因為在衰老及骨質疏松等慢性退行性變中，BMMSC并未發(fā)生根本的分化或變異，只是功能發(fā)生了一定程度的改變，不同于腫瘤或者發(fā)育階段所發(fā)生的根本轉變時觀察到的microRNA表達譜的明顯變化。對于這種輕度的改變如何顯著調控細胞的功能，可能是通過多個microRNA共同調控一個靶基因，或者是一個microRNA調控一組功能互相協(xié)同的microRNA 來實現(xiàn)的［19］。

通過對BMMSC進行成骨成脂誘導并對此過程中特定microRNA的表達進行RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn) miR-680、miR-20a、miR-29 在 2 種分化過程中都出現(xiàn)了明顯的變化，提示這些microRNA的表達變化與干細胞的分化密切相關。其中miR-680在成骨及成脂過程分化中均上升，提示miR-680可能調控了抑制細胞分化的靶基因，其升高使得這類抑制性靶基因下調，促進細胞的分化進程;而miR-20a和miR-29a在成骨及成脂分化過程中均下降，提示其可能調控的是促進細胞分化的靶基因，其下調使得對這些靶基因的轉錄后調控減弱，促進其表達，加快分化進程。不過，增殖與分化是2個緊密聯(lián)系的細胞生命活動，前期實驗也提示干細胞在分化過程中增殖將受到明顯的抑制，所以也不排除這些microRNA可能與細胞的增殖相關，其影響的是細胞增殖能力的改變。

本實驗結果顯示，多個microRNA在成骨過程中的改變趨勢與其在骨質疏松過程中的變化趨勢不一致;而成脂分化過程中的變化趨勢與骨質疏松過程中的變化趨勢是一致的。這一方面可能是特定microRNA可以調控一系列的靶基因，從而與細胞多種功能相關，其在骨質疏松狀態(tài)下的變化不一定單純反映BMMSC成骨分化功能的改變，也可能反映的是干細胞增殖、凋亡或者因子分泌功能的改變［18］。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-335在成脂和成骨過程中均呈下降趨勢，而且其改變不僅對于細胞分化產(chǎn)生影響，還能夠同時影響細胞的增殖和遷移能力［20］。另一方面，因為BMMSC成骨成脂這兩種分化方向處于一種互相拮抗的狀態(tài)，如果其成脂功能異常增強將導致骨質疏松，而骨密度異常增高的患者表現(xiàn)出BMMSC的成脂能力缺陷。在成骨及成脂分化的過程中，例如RUNX2、PPAR-γ、TAZ等基因發(fā)揮著重要的開關作用，能夠控制細胞的分化方向［20］。所以如果microRNA的靶基因是調控成脂分化的關鍵開關基因，那其在骨質疏松狀態(tài)中的改變將對于BMMSC的成脂分化起到較強的促進作用，控制其定向分化，這可能抵消此microRNA對于成骨分化的反向調節(jié)作用［5］。

我們通過靶基因預測軟件(TargetScan，PicTar，Miranda)對所選的差異性表達microRNA的功能進行了初步預測，發(fā)現(xiàn)每個microRNA都能夠調控大量靶基因，其中部分基因與細胞的增殖、分化、凋亡密切相關。這些基因互相聯(lián)系，形成一個復雜的細胞命運調控網(wǎng)絡，對細胞進行精確調控［21］。由此可以提出一個假設:雌激素通過直接或間接作用維持BMMSC內部特定microRNA表達譜的穩(wěn)定，后者通過轉錄后調控控制一系列靶基因的表達穩(wěn)態(tài)，控制BMMSC正常的生物學行為，維持骨改建過程的穩(wěn)態(tài)平衡。當雌激素水平下降后，BMMSC中microRNA表達譜穩(wěn)態(tài)受到破壞，進而引起下游靶基因表達異常，改變BMMSC的生物學行為，最終導致骨質疏松的發(fā)生。但是，這些假設還有待后續(xù)實驗進一步的驗證。

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