孔飛娟，唐郁文，徐麟浩，張曉明，魯惠順

(1.浙江大學醫(yī)學院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，浙江杭州，310006;2.浙江大學醫(yī)學院人體解剖教研室，浙江杭州，310058)

隨著醫(yī)學技術(shù)的快速發(fā)展，孕期婦女在全身麻醉下行胎兒手術(shù)及妊娠期非產(chǎn)科手術(shù)等與分娩無關(guān)的手術(shù)日益增多。由于大多數(shù)全身麻醉藥很容易通過胎盤，因此胎兒接觸麻醉藥物的概率相當大。異氟醚是臨床上常用的吸入性麻醉藥物，同時也廣泛應用于動物研究。越來越多的動物研究表明早期暴露于異氟醚可引起其成年后學習記憶能力的缺陷［1-2］。同時，臨床也發(fā)現(xiàn)，兒童期手術(shù)和麻醉與其后行為的異常和認知的障礙存在相關(guān)性［3-4］。這些發(fā)現(xiàn)引起了人們對全身麻醉藥物對胎兒、新生兒以及嬰幼兒潛在的有害影響的關(guān)注。但是，異氟醚對胎兒神經(jīng)發(fā)育影響的相關(guān)報道卻很少。

生長相關(guān)蛋白-43(growth associated protein-34，Gap-43)是一種神經(jīng)細胞膜上的特異性磷蛋白，它在整個大腦發(fā)育期間均維持在一個較高的水平，是公認的神經(jīng)元發(fā)育、神經(jīng)生長、再生、突觸形成和重建的標志蛋白質(zhì)［5］。而神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)是一種36個氨基酸的多肽，主要分布在大腦皮層、丘腦、下丘腦、腦干等處，NPY作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，有一項重要作用是對海馬學習記憶功能的調(diào)節(jié)［6］。為此，本研究觀察大鼠孕期吸入異氟醚對子代學習記憶功能的影響，并通過檢測仔鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞GAP-43和NPY的表達來探討異氟醚引起認知功能障的機制。

1 材料和方法

1.1 動物選擇及分組 清潔級Sprague-Dewley大鼠12只，孕18 d，體質(zhì)量380～420 g(浙江大學醫(yī)學院實驗動物中心提供)，隨機分成2組:對照組和異氟醚處理組，每組6只。

1.2 異氟醚吸入 將孕18 d的SD大鼠放入20 cm×12 cm×10 cm自制麻醉箱內(nèi)實施麻醉，該麻醉箱放置于預設溫度為38℃的水浴箱中，以維持環(huán)境溫度的穩(wěn)定。在麻醉箱的兩側(cè)各有一小孔，一側(cè)孔連接 Ohmeda 210麻醉(Datex-Ohmeda公司，芬蘭)輸入氧氣和麻醉氣體，通過調(diào)節(jié)揮發(fā)罐吸入濃度控制麻醉氣體輸出濃度，另一側(cè)孔連接 F-MCI氣體監(jiān)測儀(Datex-Ohmeda公司，芬蘭)監(jiān)測流出氣體中異氟醚、氧氣及二氧化碳濃度。對照組吸入含有30%氧氣的空氧混合氣體;異氟醚組使用1.3%異氟醚(批號826005U，ABBOTT 公司，美國)處理6 h，此過程保持麻醉箱內(nèi)氧濃度為30%。在異氟醚麻醉過程中，用帶狀嬰兒脈搏血氧飽和度探頭貼于孕鼠腹部，持續(xù)監(jiān)測SpO2和HR，以防止麻醉過深導致孕鼠大腦缺氧。同時，在異氟醚處理6 h后經(jīng)孕鼠尾靜脈取血檢測血糖濃度。然后，將孕鼠放回籠中，待其自然分娩。所有幼鼠均成活。

1.3 Morris水迷宮實驗 從每只孕鼠子代中隨機取出雌性和雄性各2只出生4周的幼鼠，進行水迷宮測試。參照以前的實驗方法［1］，Morris水迷宮(淮北正華生物儀器設備有限公司)由一個直徑120 cm、高50 cm的圓形水池構(gòu)成，劃分為4個象限，每個象限設置入水點標記，于第三象限內(nèi)設一直徑12 cm、高29 cm的透明平臺，槽內(nèi)水深30 cm，使平臺沒于水下1 cm，水溫控制在23℃ ～25℃，水池上方安裝自動攝像系統(tǒng)。水迷宮實驗包括定向?qū)Ш綄嶒灪涂臻g探索實驗，共進行5 d。其中，定向?qū)Ш綄嶒灋槠? d，從大鼠出生后第29天持續(xù)到第32天，檢測大鼠對水迷宮學習和記憶的能力，每天訓練4次，上午9:00-11:00;將大鼠分別從4個象限入水點面向 池壁放入水中，記錄120 s內(nèi)尋找到平臺的時間(逃逸潛伏期)，并讓大鼠在平臺上停留20 s，超過120 s未能找到平臺者，用木棒輕柔的將其引上平臺并停留20 s，將其尋找平臺時間定為120 s，取4次測定結(jié)果的平均值為當天的逃逸潛伏期?？臻g探索實驗為期1 d，于大鼠出生后第33天進行，測試大鼠對平臺空間位置記憶的能力，撤去平臺，從任一象限將大鼠面向槽壁放入水中，記錄120 s內(nèi)在原平臺處穿越次數(shù)以及第三象限活動時間。用Morris水迷宮數(shù)據(jù)采集和分析軟件記錄相關(guān)數(shù)據(jù)及圖像結(jié)果。

1.4 免疫組織化學 Morris水迷宮試驗結(jié)束后，每組隨機取6只仔鼠用1%戊巴比妥鈉(40 ml/kg)腹腔注射麻醉，快速開胸暴露心臟，經(jīng)左心室向升主動脈內(nèi)插管灌注生理鹽水及4%冷多聚甲醛固定液。取出腦組織置于相同固定液內(nèi)。將保存在多聚甲醛固定液的腦組織取出，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋。自上丘至視交叉節(jié)段由頭側(cè)向尾側(cè)行冠狀連續(xù)切片，片厚5 mm，貼附于涂有鉻礬明膠的載玻片上，進行GAP-43和NPY酶標免疫組織化學染色。待抗原修復后加入第一抗體液(兔抗大鼠GAP-43單克隆抗體1∶100，兔抗大鼠NPY多克隆抗體1∶100，Santa Cruz 公司，美國)。濕盒孵育，4℃過夜;以PBS代替一抗作陰性對照。二抗采用HRP標記羊抗兔多聚體，DAB顯色，顯微鏡下控制時間，充分沖洗中止反應，蘇木素復染、脫水、透明、封固。每只大鼠各取1張相同部位DAB染色切片，采用 UTHSCSA Image T001s 3.0(美國德克薩斯大學醫(yī)學院開發(fā))圖像分析處理系統(tǒng)進行分析，統(tǒng)計切片單位面積內(nèi)(mm2)陽性細胞的數(shù)量和光密度。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.0進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，定向?qū)Ш綄嶒炛薪M內(nèi)各天數(shù)間比較采用重復測量方差分析，其它數(shù)據(jù)采用Student's t-test進行組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 孕鼠吸入誘導劑量的異氟醚數(shù)分鐘內(nèi)翻正反射均消失，呈持續(xù)睡眠狀態(tài)。鼻唇、趾端膚色保持紅潤，呼吸頻率＞90次/min，SpO2和HR無明顯波動。對照組和異氟醚組處理前后血糖差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，對照組:(6.22 ±1.33)mmol/L vs(6.44±0.05)mmol/L，異氟醚組:(6.42 ± 1.43)mmol/L vs(6.50 ±0.89)mmol/L。

2.2 Morris水迷宮實驗 在定向?qū)Ш綄嶒炛?，異氟醚組仔鼠每天平均逃逸潛伏期均明顯比對照組長(P＜0.05)，見表1;空間探索實驗中，異氟醚組仔鼠第三象限活動時間明顯短于對照組［(48.76 ±3.52 vs 35.08 ± 4.33)s，P ＜ 0.05］，穿越原平臺次數(shù)明顯比對照組少(3.95±1.39 vs 2.78 ±1.40，P ＜0.05)。

表1 各組仔鼠定向?qū)Ш綄嶒灲Y(jié)果Table 1 The results of place navigation test in both group

2.3 免疫組化檢測 GAP-43在兩組仔鼠的額葉皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)、齒狀回區(qū)神經(jīng)元胞體和突起的胞膜上均有表達;但是，異氟醚組仔鼠神經(jīng)元表達GAP-43強度較對照組明顯下降(圖1-A、B)，其中異氟醚組仔鼠在海馬CA1區(qū)單位面積表達GAP-43的細胞數(shù)量為(1.55±0.31)個/mm2，光密度為 58.98 ±4.05，而對照組仔鼠表達 GAP-43的細胞數(shù)量為(2.80±0.47)個/mm2，光密度為 69.24 ±5.58，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。

NPY在兩組仔鼠的海馬CA1區(qū)中均有表達，異氟醚組仔鼠NPY表達陽性的神經(jīng)細胞數(shù)目較對照組有明顯減少(圖2-A、B)，其中異氟醚組仔鼠在上述區(qū)域單位面積表達NPY的細胞數(shù)量為 1.91 ±0.34 個/mm2，光密度為 53.92±6.16，而對照組仔鼠表達NPY的細胞數(shù)量為(4.10 ± 0.38)個/mm2，光密度為 62.28 ±5.53，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。

3 討論

異氟醚在臨床上常用于各種手術(shù)的麻醉，包括妊娠期胎兒手術(shù)、妊娠期非產(chǎn)科手術(shù)，以及嬰幼兒和新生兒手術(shù)的麻醉。從神經(jīng)突觸發(fā)育的成熟度方面來對比，懷孕18 d的胎鼠腦發(fā)育程度相當于人類孕中期的胎兒［7］。臨床上胎兒手術(shù)及孕期非產(chǎn)科手術(shù)的時間多選擇在孕中期進行［8］，因此本研究選擇該時間點作為麻醉處理點。異氟醚最低有效肺泡濃度為1.1% ～1.2%［9］，而滿足臨床手術(shù)常用所需最低有效肺泡濃度為1.2% ～1.3%，因此本研究選用1.3%異氟醚處理。實驗結(jié)果顯示，1.3%異氟醚麻醉對孕鼠呼吸無明顯影響，PaO2及PaCO2在正常范圍;孕鼠SpO2和HR也在正常范圍，未見呼吸抑制，血糖在正常范圍，排除了低氧和低血糖對實驗結(jié)果的干擾。Morris水迷宮實驗是研究與海馬功能直接相關(guān)的空間學習和記憶的一種經(jīng)典模型，定向?qū)Ш綄嶒灥奶右轁摲诳煞从倡@取空間信息的能力，而空間探索實驗的行為反映了對在定向?qū)Ш綄嶒炛杏柧毇@取信息的記憶儲存及再現(xiàn)能力。本實驗發(fā)現(xiàn)孕鼠吸入異氟醚后，仔鼠在水迷宮實驗中的逃逸潛伏期明顯延長，而在原逃逸平臺所處的第三象限的活動時間和穿越原平臺位置的次數(shù)均明顯減少，提示子代大鼠學習空間信息的能力和對獲取的信息的記憶功能可能受到影響。

學習和記憶是認知功能的兩個重要方面。而海馬是學習記憶的關(guān)鍵腦區(qū)，該區(qū)突觸可塑性是學習記憶的物質(zhì)基礎，尤其在海馬CA1區(qū)和DG區(qū)［10］。GAP-43是突觸可塑性的標志性蛋白，廣泛分布于神經(jīng)元，尤其在正在發(fā)育的軸突以及突觸前末梢，參與軸突的生長，突出再生，突出重塑以及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中，GAP-43是神經(jīng)元發(fā)育和再生的一個重要因子，GAP-43不僅能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元對軸突引導信號的反應，而且在引導軸突生長和調(diào)節(jié)軸突形成新的聯(lián)系上也起關(guān)鍵作用，是神經(jīng)元發(fā)育和可塑性的分子標志物［11］。GAP-43和PKC基因的過表達明顯增強轉(zhuǎn)基因鼠的長時程增強(long term potential，LTP)和學習能力，因LTP與記憶有關(guān)，表明GAP-43基因與學習、記憶的調(diào)節(jié)有關(guān)［12］。也有研究發(fā)現(xiàn)GAP-43的表達在認知功能損害的糖尿病大鼠腦中海馬區(qū)的表達下降，說明GAP-43與學習及記憶能力密切相關(guān)［13］。實驗結(jié)果顯示，GAP-43在異氟醚組仔鼠的海馬CA1區(qū)表達明顯減少，這與異氟醚組仔鼠在水迷宮實驗中表現(xiàn)出的記憶和空間認知能力下降相吻合，顯示腦內(nèi)GAP-43的減少影響突觸和突觸連接的形成，從而引起了認知功能的下降。

此外，NPY作為一種神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)可促進海馬的神經(jīng)前體細胞的增殖［14］。既往國外已有多項研究顯示，在伴有學習記憶損害的疾病中見到中樞神經(jīng)系統(tǒng)NPY免疫反應陽性神經(jīng)元含量明顯下降。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠第三腦室注射NPY，觀察小鼠在跳臺被動回避反應中學習記憶能力的變化，結(jié)果提示NPY對記憶的鞏固和再現(xiàn)有明顯的促進作用［15］。進一步研究還表明，NPY不但與長時記憶存在密切關(guān)系，也可顯著影響短時記憶的準確性［16］，說明NPY表達程度的多少，是決定學習記憶能力的細胞和分子基礎，這與同類研究的結(jié)論一致［17-18］。本研究觀察到NPY免疫反應陽性神經(jīng)細胞在異氟醚組仔鼠海馬CA1區(qū)明顯減少，提示NPY可能與異氟醚引起的學習記憶傷害有關(guān)。

綜上所述，大鼠孕期吸入異氟醚后可引起子代學習記憶功能降低，這可能與GAP-43和NPY的表達下調(diào)有關(guān)，其深入機制有待于進一步研究。

［1］JEVTOVIC-TODOROVIC V， HARTMAN RE，IZUMI Y，et al.Early exposure to common anesthetic agents causes widespread neurodegeneration in the developing rat brain and persistent learning deficits ［J］.J Neurosci，2003，23(2):876-882.

［2］CULLEY D J，BAXTER M G，YUKHANANOV R，et al.Long-term impairment of acquisition of a spatial memory task following isoflurane-nitrous oxide anesthesia in rats［J］.Anesthesiology，2004，100(2):309-314.

［3］MONK T G，WELDON B C，GARVAN C W，et al.Predictors of cognitive dysfunction after major noncardiac surgery［J］.Anesthesiology，2008，108(1):18-30.

［4］MICKELSON C，GLEICH S J，SCHROEDER D R，et al.Early exposure to anesthesia and learning disabilities in a population-based birth cohort［J］.Anesthesiology，2009，110(4):796-804.

［5］CHIRWA S，ADUONUM A，PIZARRO J，et al.Dopaminergic DA1 signaling couples growthassociated protein-43 and long-term potentiation in guinea pig hippocampus ［J］.Brain Res Bull，2005，64(5):433-440.

［6］CABERLOTTO L，F(xiàn)UXE K， HURD Y L.Characterization of NPY mRNA-expressing cells in the human brain:co-localization with Y2 but not Yl mRNA in the cerebral cortex，hippocampus，amygdala，and striarum ［J］.J Chem Neuroanat，2000，20(3-4):327-337.

［7］CLANCY B，KERSH B，HYDE J，et al.Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans ［ J］.Neuroinformatics，2007，5(1):79-94.

［8］TRAN K M.Anesthesia for fetal surgery［J］.Semin Fetal Neonatal Med，2010，15(1):40-45.

［9］ORLIAGUET G，VIVIEN B，LANGERON O，et al.Minimum alveolar concentration of volatile anesthetics in rats during postnatal maturation ［J］.Anesthesiology，2001，95(3):734-739.

［10］SAMETSKY E A，DISTERHOFT J F，GEINISMAN Y，et al.Synaptic strength and postsynaptically silent synapses through advanced aging in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons ［J］.Neurobiology of Aging，2010，31(5):813-825.

［11］MIYAKE K，YAMAOTO W，TADOKORO M，et al.Alterations in hippocampal GAP-43，BDNF，and L1 fowllowing sustained cerebral ischemia［J］.Brain Res，2002，935(1-2):24-31.

［12］XIAO N，LI S Z，ZHANG X P，et al.Effect of ephedrine on neuronal plasticity of hypoxicischemic brain damage in neonatal rats ［J］.Neurosci Lett，2008，435(2):99-102.

［13］ZHOU J W，WANG L L，LING S C，et al.Expression changes of growth-associated protein-43(GAP-43)and mitogen-activated protein kinase phosphatase-1(MKP-1)and in hippocampus of streptozotocin-induced diabetic cognitive impairment rats［J］.Experimental Neurology，2007，206(2):201-208.

［14］HOWELL O W，SCHARFMAN H E，HERZOG H，et al.Neuropeptide Y is neuroproliferative for postnatal hippocampal precursor cells ［J］.Neurochern，2003，86(3):646-665.

［15］NAKAJIMA M，INUI A，TERANISHI A，et al.Effects of pancreatic polypeptide family peptides on feeding and learning behavior in mice［J］.J Pharmacol Exp，1994，268(2):1010-1014.

［16］CLEARY J，SEMOTUK M，LEVINE A S.Effects of neuropeptide Y on short-term memory ［J］.Brain Res，1994，653(1-2):210-214.

［17］HAYLEY S，POULTER M O，MERALI Z，et al.The pathogenesis of clinical depression:stressorand cytokine-induced alterations of neuroplasticity［J］.Neuroscience，2005，135(3):659-678.

［18］SILVA A P，XAPELLI S，PINHEIRO P S，et al.Up-regulation of neuropeptide Y levels and modulation of glutamate release through neuropeptide Y receptors in the hippocampus of kainite-induced epileptic rats［J］.J Neurochem，2005，93(1):163-170.