于 捷，樓國東，岳佳星，侯偉偉，潘建春，張世紅，陳 忠

(1.浙江大學藥學院，浙江杭州 310058;2.溫州醫(yī)學院藥學院，浙江 溫州 325000)

癲癇是一種嚴重的慢性中樞神經系統(tǒng)疾病，是由反復發(fā)作、高度同步化的大腦神經元異常放電導致的暫時性大腦功能失調，臨床表現為運動、感覺、意識、植物神經和精神等不同障礙。目前對于癲癇的發(fā)生機制所知甚少，臨床上使用的抗癲癇藥物只能控制或預防癲癇發(fā)作，而對癲癇發(fā)生過程沒有作用。大約有30%的患者由于對藥物治療不敏感或無法耐受藥物的副反應，發(fā)展成為難治性癲癇。部分難治性癲癇患者可通過手術切除灶點或切斷灶點與其他腦區(qū)的聯系得到緩解，但是手術本身也會造成大腦正常功能的嚴重缺失。深部腦刺激(deep brain stimulation，DBS)是通過向患者腦內植入電極并對局部腦區(qū)進行電刺激的一種治療手段。目前高頻率的DBS已被用于臨床治療耐藥性癲癇。但高頻率電刺激具有組織損傷、治療效果不穩(wěn)定等問題，所以安全性與可控性更好的低頻率電刺激(low-frequency stimulation，LFS)逐漸引起了研究者的興趣。近期的研究表明，LFS灶點部位能抑制成年及未成年大鼠杏仁核電點燃癲癇的形成過程［1-3］，本實驗室前期的實驗也發(fā)現，LFS小腦頂核［4］、中央梨狀皮層［5-6］等區(qū)域可以顯著抑制杏仁核電點燃癲癇的發(fā)生與發(fā)展。

疼痛是一種在人類生活中無法避免的主觀情緒體驗，也是臨床最常見的主要或伴隨癥狀之一。世界衛(wèi)生組織將其定義為:“組織損傷或潛在組織損傷引起的不愉快的感覺和情感體驗”。按發(fā)作程度與持續(xù)時間不同，疼痛可分為急性和慢性兩種類型，后者又可進一步劃分為炎癥引起的炎癥性疼痛和各種神經損傷引起的神經病理性疼痛(neuropathic pain，NP)。發(fā)生在中樞神經系統(tǒng)的中樞敏化被認為是NP發(fā)病的主要原因，表現為興奮性突觸傳遞增強，抑制性突觸減弱，出現自發(fā)疼痛;或者放大外周的傳入沖動，誘發(fā)異常疼痛。這些變化與中樞內一系列復雜的病理生理改變有關，如GABA類遞質釋放減少及其受體表達下調［3］;谷氨酸釋放及谷氨酸轉運體功能異常［7］;五羥色胺(5-HT)、腎上腺素能遞質系統(tǒng)的改變以及阿片類受體表達異常等。

目前臨床上對NP的治療尚面臨許多困難，三環(huán)類抗抑郁藥、阿片受體激動劑、某些抗癲癇藥可緩解部分NP患者的癥狀。第一代抗癲癇藥物卡馬西平和苯妥英鈉，對三叉神經痛有明顯的治療效果;新一代抗癲癇藥物加巴噴汀和拉莫三嗪也對多種 NP類型有緩解作用［8］。另外，一些臨床試驗提示，DBS也可能成為治療NP的一個新的手段，因為電刺激導水管/腦室周圍灰質或感覺丘腦對NP具有部分緩解作用［9］。但是，目前對于NP與癲癇發(fā)生是否存在相互影響，低頻率電刺激杏仁核對NP有何種作用，均未見報道。因此，本實驗旨在研究大鼠在癲癇形成的不同階段，自發(fā)性NP的敏感性是否發(fā)生改變;同時，探討LFS癲癇灶點是否會影響癲癇大鼠對自發(fā)性NP的敏感性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 實驗采用雄性SD大鼠，由浙江大學實驗動物中心提供，體重240～290 g，飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級。行為學觀察在10:00-17:00間進行。所有實驗操作嚴格按照國際疼痛研究學會(the international association for the study of pain，IASP)標準進行［10］。

1.2 儀器與藥品 手術顯微鏡(江蘇中天)，小動物氣體麻醉機(美國Matrx公司)，顯微手術器械(美國 Stoelting)，腦立體定位儀(Narishige，日本)，恒流電刺激儀(Nihon Kohden，Japan)，刺激隔離器，PowerLab電生理記錄系統(tǒng)(AD instruments，Australia)，以及異氟烷和10%水合氯醛。

1.3 手術

1.3.1 癲癇模型制備 大鼠用水合氯醛麻醉(360 mg/kg，腹腔注射)，固定于立體定位儀上，暴露顱骨，根據Paxinos＆Waston腦圖譜，將電極置入大鼠右側基底旁側杏仁核(從前囟算起，AP:-2.8 mm，L:-4.8 mm，V:-8.8 mm)。電極為Teflon絕緣的雙極螺旋不銹鋼電極，直徑為0.2 mm，末端0.5 mm 刮掉絕緣層，雙極間距0.5 mm。電極用牙科水泥固定于大鼠顱骨上，其尾端連接一個微型插座。手術后動物至少恢復10 d。

1.3.2 神經瘤模型制備 大鼠于麻醉盒中以4%異氟烷誘導深度麻醉，繼之以2%異氟烷維持。在左后肢手術野剃毛消毒后，于腘窩上接近大腿正中暴露坐骨神經，在神經干三支分叉近端，用5-0絲線結扎坐骨神經干并剪斷。為防止神經再生，再剪除遠端坐骨神經約5 mm。在手術顯微鏡下，于股內側暴露隱神經，剪斷并剪除遠端殘端2～3 mm，以防止再生。

1.4 大鼠杏仁核癲癇電點燃實驗過程和LFS采用恒流電刺激儀，給予大鼠基底旁側杏仁核電刺激(60 Hz，持續(xù)1 s，脈沖間隔1 ms)，用腦電記錄系統(tǒng)記錄杏仁核的腦電(EEG)。在電點燃刺激前一天，測定杏仁核的后放電閾值(ADT)。刺激強度從100 μA開始，每隔 30 min增加20 μA，直到誘發(fā)的后放電持續(xù)時間(ADD)不少于5 s。此時的電流強度即為ADT，并以此電流強度作為此后每天電點燃刺激的強度。癲癇的發(fā)作級別參考Racine［11］在1972年提出的判斷標準:1級為面部陣攣，咀嚼明顯;2級為節(jié)律性點頭;3級為單側前肢抬起陣攣;4級為雙側前肢抬起陣攣并站立;5級為雙側前肢陣攣，站立以及失去平衡跌倒。癲癇級別中的1～3級為局灶性癲癇，而4～5級則為全身性癲癇。取到達不同級別癲癇發(fā)作的大鼠，制備神經瘤模型。神經切斷術后第1天開始，每天通過刺激電極給予右側基底旁側杏仁核15 min的LFS，刺激參數為單向方波，頻率1 Hz，波寬 0.1 ms［5］。

1.5 神經瘤模型術后行為學觀察 神經瘤模型手術后，大鼠會表現出舔/咬傷側后爪的自噬行為，這種行為作為評價自發(fā)性神經病理性疼痛的敏感程度。自噬程度用0～11分定量評價。評分標準:2個或以上趾甲被噬，計1分;每1個第一、第二趾節(jié)被噬，累加1分，最高分值11分［12-13］。所有動物都單籠單只飼養(yǎng)，避免群居生活影響自噬行為［14］。

1.6 實驗分組 實驗動物分為5組，分別是①對照組(n=7)，動物僅作杏仁核電極植入和神經瘤模型，不做點燃刺激和LFS;②局灶性癲癇組(n=5)，動物在癲癇進展到1～3級時，做神經瘤模型;③全身性癲癇組(n=7)，動物在癲癇進展到4～5級時，做神經瘤模型;④局灶性癲癇+LFS組(n=4)，動物在癲癇進展到1～3級時，做神經瘤模型，術后給予LFS;⑤全身性癲癇+LFS組(n=4)，動物在癲癇進展到4～5級時，做神經瘤模型，術后給予LFS。

2 結果

2.1 局灶性癲癇組大鼠對自發(fā)性NP的敏感性下降 在局灶性癲癇階段(發(fā)作級別1～3級)的大鼠，神經損傷誘發(fā)的NP嚴重程度低于對照組。自噬平均分值在術后第40～63天經重復測量檢驗有顯著性差異(圖 1A，P＜0.05)，自噬行為發(fā)展的 AUC(45.80 ±24.64)比對照組大鼠(308.20±51.57)顯著降低(表1，P＜0.05)。癲癇進展到全身性癲癇階段(發(fā)作級別4～5級)的大鼠對自發(fā)性NP的敏感性與對照組相比，沒有顯著性差異(圖1B和表1，P ＞0.05)。

2.2 局灶性癲癇組與全身性癲癇組大鼠自噬發(fā)生時間均延遲 對照組大鼠在神經損傷后發(fā)生自噬行為的平均時間為術后(8.0±2.1)d。局灶性癲癇組大鼠發(fā)生自噬行為的平均時間為(40.6 ±9.7)d，全身性癲癇組大鼠為(24.1 ±6.7)d(表1)，均比對照組大鼠顯著推遲(P值分別 ＜0.01 和 ＜0.05)。

表1 各組動物自噬行為進展的曲線下面積和自噬行為開始時間Table 1 AUC and onset day in rats of different groups(ˉx)

表1 各組動物自噬行為進展的曲線下面積和自噬行為開始時間Table 1 AUC and onset day in rats of different groups(ˉx)

與對照組相比，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01.

組 別 n AUC 開始時間7 309.64 ±51.68 8.0 ±2.1局灶性癲癇組 5 45.80 ±24.65*40.6 ±9.7＊＊全身性癲癇組 7 214.36 ±73.34 24.1 ±6.7*局灶性癲癇組 +LFS 4 263.63 ±55.00 8.5 ±1.0全身性癲癇組/d對照組+LFS 4 264.25 ±64.02 10.5 ±3.3

2.3 局灶性癲癇組大鼠自噬等級和高分值發(fā)生率降低 對照組動物在神經損傷后第63天(觀察終止日)自噬分值的分布高于局灶性癲癇組大鼠(圖2A)，前者絕大多數大鼠表現出高分值(9分以上，71.4%)，而后者沒有1例自噬分值大于9，高分值發(fā)生率兩組之間差異顯著(P＜0.05，圖2B)。全身性癲癇組大鼠的自噬分值分布與對照組相似(圖2C)，高分值發(fā)生率(50%)與對照組沒有顯著性差異(圖2D)。

2.4 低頻率電刺激癲癇灶點使局灶性癲癇組大鼠對自發(fā)性NP的敏感性恢復 低頻率電刺激局灶性癲癇組大鼠的癲癇灶點杏仁核21 d期間及結束LFS至觀察結束，動物的自噬行為分值比未給予LFS的局灶性癲癇大鼠顯著升高，達到與對照組大鼠相似的水平(圖1A)。LFS處理組自噬行為進展的AUC和自噬發(fā)生時間與對照組大鼠相比無顯著性差異(P＞0.05);在觀察終止日的自噬分值分布和高分值百分比與對照組大鼠相似(圖2 A和B)。

圖1 局灶性(A)和全身性(B)杏仁核電點燃癲癇大鼠自噬行為進展及低頻率電刺激灶點的作用Fig.1 The progression of autotomy in rats with focal(A)and generalized(B)amygdaloid-kindling induced seizures and effects of low frequency stimulation at the amygdala

2.5 低頻率電刺激癲癇灶點不影響全身性癲癇組大鼠對自發(fā)性NP的敏感性 在低頻率電刺激杏仁核期間及以后，全身性癲癇組大鼠對自發(fā)性NP的敏感性與對照組相比無差異，經低頻率電刺激21 d后，也沒有發(fā)生顯著性變化(圖1、圖2和表1)。

圖2 局灶性(A和B)和全身性(C和D)杏仁核電點燃癲癇大鼠自噬行為分值分布圖和高分值自噬行為的發(fā)生率及低頻率電刺激灶點的作用Fig.2 The distribution of autotomy scores and percentage of high autotomy in rats with focal(A and B)and generalized(C and D)amygdaloid-kindling induced seizures and effects of low frequency stimulation at the amygdala

3 討論

坐骨神經切斷術建立的神經瘤模型，被廣泛用來模擬臨床上自發(fā)性神經病理性疼痛，而自噬行為則被用以評價自發(fā)性NP的嚴重程度［15-16］。本實驗發(fā)現，電點燃刺激誘發(fā)大鼠癲癇，可以抑制坐骨神經切斷產生的自發(fā)性神經病理性疼痛，表現為癲癇組大鼠術后自噬行為的等級下降，開始時間推遲，觀察終止日的高分值百分比也下降。更為有趣的是，這種抑制作用在局灶性癲癇(發(fā)作等級1-3級)組大鼠表現猶為明顯。給予杏仁核LFS后，局灶性癲癇組大鼠對神經病理性疼痛的敏感性恢復到對照組水平。本實驗結果提示在癲癇發(fā)生的早期(局灶性癲癇期)，大鼠對自發(fā)性NP的敏感性降低;隨著癲癇進展至全身性發(fā)作期，大鼠對NP的敏感性恢復。LFS癲癇灶點可以抑制因癲癇發(fā)作導致的自噬行為的改變。

癲癇的形成過程被認為是一個動態(tài)、漸進的病理過程。在首次出現自發(fā)性癲癇發(fā)作之前，常伴隨著中樞神經元興奮性的持續(xù)上升，興奮性網絡的逐漸形成以及神經退行性變、神經發(fā)生、神經膠質形成等復雜的結構性改變［17］。同時，還在突觸可塑性、神經遞質代謝等方面發(fā)生改變。這一系列改變多數也存在于神經病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展過程中。以興奮性神經遞質谷氨酸為例，During等人報道患有正中顳葉癲癇患者的腦中細胞外谷氨酸濃度上升［18］。在海馬區(qū)域給予谷氨酸或谷氨酸類似物，可以誘發(fā)癲癇，而給予谷氨酸受體拮抗劑可以抑制癲癇發(fā)作［19］。同時，有研究報道阻斷脊髓中谷氨酸轉運體的功能可以誘導大鼠出現熱痛超敏和機械痛過敏［20-21］。由慢性神經損傷、化學療法損傷或者阿片類物質損傷導致的痛覺超敏都與它們對脊髓背角谷氨酸轉運體的抑制作用有關。大量研究顯示，免疫系統(tǒng)的異常也發(fā)生于顳葉癲癇疾病過程中。在癲癇持續(xù)性發(fā)作之前，腦部炎癥狀態(tài)可以從最初的組織創(chuàng)傷開始一直持續(xù)存在于整個癲癇形成過程中［22］，如腦組織中小膠質細胞激活、星形膠質細胞增生，以及淋巴細胞等各種炎癥細胞的聚集浸潤等［23］。而在神經損傷之后，脊髓內也檢測到類似的炎癥反應并與中樞敏化的發(fā)生密切相關［24］。

上述研究表明，癲癇和神經病理性疼痛在發(fā)病機制上存在一定的相似性?？R西平和苯妥英鈉這兩種經典的抗癲癇藥物對三叉神經痛的緩解作用就與阻斷鈉通道，降低神經元興奮性有關。所以我們推測，在癲癇發(fā)生過程中，上述組織學和病理生理學的改變會導致動物對NP更加敏感。在本實驗中，我們意外發(fā)現癲癇大鼠，特別是局灶性癲癇大鼠對神經瘤模型誘導的自發(fā)性NP敏感性降低。這些結果提示，腦內參與癲癇形成的某些機制抑制而非促進了神經損傷后中樞敏化過程，降低了對自發(fā)性NP的敏感性;而在癲癇形成之后，抑制作用減弱或解除，自發(fā)性NP受到的影響較小，因而出現了不同癲癇發(fā)展階段自噬行為程度的分離。

目前尚缺乏實驗數據用以解釋在癲癇發(fā)生過程中動物為什么對NP的敏感性降低。但是，已知杏仁核電點燃癲癇的進展涉及從杏仁核經前穿質到海馬結構這個癲癇環(huán)路的募集和異常網絡的形成。癲癇的形成過程即這個環(huán)路逐漸發(fā)展形成，相關神經元興奮性逐漸增加的過程。而NP的發(fā)生涉及到的主要是感覺通路，與癲癇發(fā)生密切相關的杏仁核、海馬等邊緣系統(tǒng)結構主要參與疼痛引起的情緒反應。我們不排除癲癇促進其他類型NP的可能，但我們的實驗至少提示，雖然癲癇和NP在發(fā)生機制上存在相似性，但由于繼發(fā)于癲癇的一系列組織和病理生理學改變(包括機體由于自我保護而發(fā)生的一系列代償性變化)在發(fā)生區(qū)域或時程方面與NP不同，癲癇特別是局灶性癲癇的存在降低了動物對自發(fā)性NP的敏感性。具體哪些組織學和病理生理學改變發(fā)揮了局灶性癲癇對自發(fā)性NP敏感性的抑制作用，需要進一步深入研究。

我們實驗室以往的研究發(fā)現，LFS杏仁核可抑制癲癇發(fā)生［25］。本研究發(fā)現LFS杏仁核取消了癲癇對自發(fā)性NP的抑制作用，使癲癇大鼠對NP的敏感性恢復到了對照水平。這些結果表明，癲癇發(fā)生過程中腦內某些改變促進了癲癇的進展，卻能抑制NP的發(fā)生;而LFS杏仁核因為能抑制這些促進癲癇發(fā)生的改變，反而促進了NP的發(fā)生，進一步為癲癇大鼠對自發(fā)性NP的敏感性下降提供了佐證。此外，雖然有臨床試驗發(fā)現DBS導水管/腦室周圍灰質、感覺丘腦、內囊等腦內結構對NP具有緩解作用，并且可能發(fā)展成為一項新的治療手段［9］，但本研究結果提示杏仁核可能不是一個有效的靶點或者在進行DBS治療之前，需要充分考慮大腦所處的功能狀態(tài)。

綜上所述，本實驗結果發(fā)現在癲癇形成過程的局灶性癲癇階段，大鼠對自發(fā)性神經病理性疼痛的敏感性降低，癲癇灶點LFS可以抑制這種變化，這可能與癲癇發(fā)作早期，腦內發(fā)生的一系列組織和病理生理學改變抑制了自發(fā)性神經病理性疼痛的形成有關。其中的具體機制還需要進一步的研究加以闡明。

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