趙筱萍，陸 琳，胡 斌，王書芳

(1.天津中醫(yī)藥大學，天津 300193;2.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053;3.浙江大學藥學院，浙江 杭州 310058)

木香是菊科植物木香(Aucklandia lappa Decne.)的干燥根，具有調節(jié)胃腸運動、抗消化性潰瘍、抗炎、擴張血管及抗腫瘤等諸多藥理活性［1-2］。中醫(yī)認為，木香的功效是行氣止痛、健脾消食等。有報道稱，長期使用木香包合物可引起動物肝和腎毒性［3］。為此，有必要對中藥材木香中潛在的毒性組分進行篩查，研究其可能含有的肝和腎毒性物質。本研究采用二乙酸熒光素熒光標記的細胞模型，對木香提取物中25個化學組分進行了肝毒性快速篩查，發(fā)現(xiàn)其中10個組分對人肝癌細胞(HepG2)具有明顯的毒性;經氣相色譜-質譜聯(lián)用定性分析，C09組分的主要成分為去氫木香內酯、santamarine(或magnolialide)和 reynosin，而 C11組分的主要成分是α-木香醇和欖香醇。

1 材料與方法

1.1 儀器及材料 細胞熒光顯微成像平臺(浙江大學藥物信息學研究所開發(fā));酶標儀(Bio-Tek ELX800，美國寶特);Agilent 6890N/5973N氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)，另配有 Agilent 7683自動進樣器、NIST 2002質譜數據庫和Agilent色譜工作站。

HepG2(上海細胞庫);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司);二甲基亞砜、胰蛋白酶(Sigma公司);二乙酸熒光素(Fluorescein diacetate，F(xiàn)DA，碧云天生物技術研究所);96孔細胞培養(yǎng)板(Corning公司);甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯為分析醇(國藥集團);甲醇為色譜純(德國默克公司);高純水來自Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司);去氫木香內酯(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司)。

木香化學組分樣品共25個(采用標準組分制備法提取分離獲得)［4］。

1.2 方法

1.2.1 肝毒性組分的篩查 待測組分溶于DMSO中，得50 mg/ml儲備液，與細胞孵育的終質量濃度為 50 μg/ml。取對數生長期的HepG2細胞，以3 000個/孔接種于96孔板中，貼壁生長24 h后加入待篩查組分，共孵育48 h后采用FDA熒光標記法檢測細胞活力［4］，計算細胞的存活率并判定待篩查組分的毒性［5］，當細胞存活率低于20%時，表明該組分具有明顯毒性。另設溶劑對照組(0.1%DMSO)，各試驗組平行3份。

1.2.2 GC-MS 分析 Agilent DB-5MS 毛細管柱(0.25 mm ×30 m ×0.25 μm);載氣:高純氦氣，流速0.8 ml/min;升溫程序:柱始溫50℃，以10℃/min程序升溫至150℃保持10 min，以5℃/min程序升溫至 200℃ 保持 10 min，以10℃/min程序升溫至300℃保持5 min;進樣口溫度300℃，不分流進樣，進樣量為2μL。質譜為EI(electron ionization)離子源，離子源溫度為230℃;電離電壓:70 eV;四級桿溫度:150℃;掃描模式:全掃描，40 ～600 m/z。

2 結果

2.1 肝毒性組分的篩查 將木香藥材中分離所得的25個組分分別加入HepG2細胞中孵育，采用FDA熒光標記法篩查其中的肝毒性組分。圖1示A組分中有4個組分具有明顯毒性，分別為 A01、A05、A08 及 A09，細胞存活率依次為 0.28% ± 0.11%、0.37% ± 0.37%、13.50% ±2.11%及0.29% ±0.08%;B 組分中B12組分具有明顯毒性，細胞存活率為8.95%±1.61%;C組分中有5個組分具有明顯毒性，分別為 C05、C06、C08、C09 及 C11，細胞存活率依次為 7.65% ± 1.27%、0.26% ± 0.04%、0.22% ±0.14%、0.51% ± 0.09% 及 0.02% ±0.01%。其中溶劑對照、C09及C11組分的細胞熒光顯微圖像見圖2。

2.2 GC-MS分析 對木香肝毒性組分中低極性組分 C09、C11進行 GC-MS分析，其中 C09組分的總離子流圖見圖3?；衔铫竦谋Ａ魰r間為35.39 min，經質譜數據庫檢索并與標準品對照，鑒定為去氫木香內酯(dehydrocostuslactone)?；衔铫?、Ⅲ各主要碎片及相對豐度與文獻［6］報道基本一致，推測化合物Ⅱ為santamarine(或 magnolialide)，化合物 Ⅲ 為reynosin?；衔铫艚涃|譜數據庫檢索，匹配度較低，有待進一步分析。采用面積歸一化法確定化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的相對百分含量分別為39.01%、11.76% 和 9.04%。C11 組分的總離子流圖見圖4，根據化合物Ⅴ、Ⅵ質譜圖、質譜數據庫檢索結合文獻推測化合物Ⅴ和Ⅵ分別為α-木香醇(α-costol)和欖香醇(elemol)［6-7］，采用面積歸一化法確定其相對百分含量分別為42.39%和 10.40%。

圖1 木香中肝毒性組分篩查結果Fig.1 Screening hepatotoxic fractions from Aucklandiae Radix

圖2 溶劑對照(A)、C09組分(B)和C11組分(C)的細胞熒光顯微成像圖Fig.2 Fluorescence images of cells treated by vehicle control(A)，C09 fraction(B)and C11 fraction(C)

圖3 C09組分和去氫木香內酯的總離子流圖Fig.3 The total ion chromatogram of C09 fraction and dehydrocostuslactone

3 討論

對篩查出的2個具有明顯肝毒性的低極性組分作GC-MS分析，結果表明C09組分的主要成分為去氫木香內酯、santamarine(或magnolialide)和reynosin，而C11組分的主要成分是α-木香醇和欖香醇。這提示上述5個化學成分可能引起肝毒性。

去氫木香內酯、santamarine和 reynosin都屬于倍半萜類化合物，木香中的此類成分對腫瘤細胞有較強的細胞毒作用，具有抗腫瘤的活性［8-9］，Sun 等證實去氫木香內酯、santamarine和reynosin對HepG2細胞有殺傷作用，半數致死量分別為 3.5 μg/ml、7.5 μg/ml和 11.0 μg/ml［9］。構效關系研究認為，該類成分結構中存在α、β不飽和的γ-內酯環(huán)，能與巰基發(fā)生快速邁克爾加成反應，降低細胞內GSH含量，并對細胞內含巰基的蛋白產生氧化損傷作用［10-11］。這可以解釋C09組分產生明顯毒性的原因。而C11組分中的α-木香醇和欖香醇也是倍半萜類化合物，但不含有α、β不飽和的γ-內酯環(huán)樣結構，其可能引起肝毒性的作用機制還有待進一步研究。

圖4 C11組分的總離子流圖Fig.4 The total ion chromatogram of C11 fraction

［1］LIN Ming-xia(林 明 俠).Pharmacological and clinical research survey on Radix Aucklandiae［J］.(中醫(yī)藥信息)，2005(3):18-19.(in Chinese)

［2］WANG Xu-ying，JIA Xiao-bin，CHEN Yan(王緒穎，賈曉斌，陳 彥).Research advances of the several muxiang raw materials［J］.Journal of Chinese Medicinal Materials(中藥材)，2010，33(1):153-157.(in Chinese)

［3］FENG Guo-zheng，WANG Chun-hua，MA Xiu-jun，et al(封國崢，王春華，馬秀軍，等).Effects of CLA-ALD on long-term text in rats and beagle-dogs［J］.(遼寧中醫(yī)雜志)，2007(6):847-850.(in Chinese)

［4］JINY C，ZHAO X P，ZHANG Y F，et al.A threestage-integrative approach for the identification of potential hepatotoxic compounds from botanical products［J］.Int J Toxicol，2011，30(3):287-299.

［5］ZHAO Xiao-ping，LU Lin，ZHANG Yu-feng，et al(趙筱萍，陸 琳，張玉峰，等).Study on discriminating nephrotoxic components in zexie［J］.China Journal of Chinese Materia Medica(中國中藥雜志)，2011，36(6):758-761.(in Chinese)

［6］YANG Hui，XIE Jin-lun，SUN Han-dong(楊 輝，謝金倫，孫漢董).Study on chemical constituents of saussurea lappa［J］.(云南植物研究)，1997，19(1):85-91.(in Chinese)

［7］YANG Hui，XIE Jin-lun，SUN Han-dong(楊 輝，謝金倫，孫漢董).Research progress on the medicinal plant-Saussurea lappa ［J］.Natural Product Research and Development(天然產物研究與開發(fā))，1998，10(2):90-98.(in Chinese)

［8］WANG Lu，ZHAO Feng，HE En-qi，et al(王 潞，趙 烽，何 恩 其).Effects of eighteen sesquiterpenes from Saussurea lappa on the proliferation of six human cancer cell lines［J］.Nat Prod R es Dev(天然產物研究與開發(fā))，2008，20(5):808-812.

［9］SUN C M，SYU W J，DON M J，et al.Cytotoxic sesquiterpene lactones from the root of Saussurea lappa［J］.J Nat Prod，2003，66(9):1175-1180.

［10］BUTTURINI E，CAVALIERI E，DE PRATI A C，et al. Two naturally occurring terpenes，dehydrocostuslactone and costunolide，decrease intracellular GSH content and inhibit STAT3 activation［J］.PloS One，2011，6(5).:e20174.

［11］DEVDUTT C.Opportunity，challenge and scope of natural products in medicinal chemistry［M］.India:Research Signpost，2011:313-334.