陳慧貞，李云飛，鐘敬華，范驍輝

(浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 310058)

近年來，隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化和國(guó)際化進(jìn)程，中藥在全球的應(yīng)用日益廣泛，并受到了各國(guó)藥品監(jiān)管部門及藥物研發(fā)人員的普遍關(guān)注［1-2］。由于中藥化學(xué)組成復(fù)雜，如何進(jìn)行有效地控制中藥質(zhì)量隨之成為中藥研究和監(jiān)管部門的重要課題［3-4］。顯然，開展中藥的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)研究，鑒定出其所含的主要化學(xué)成分應(yīng)是建立科學(xué)質(zhì)量控制方法的先決條件［5-7］。

腦得生片是一種臨床上常用于治療腦動(dòng)脈硬化、缺血性腦卒中和腦出血后遺癥等的復(fù)方制劑［8］，其主要由三七、川芎、葛根、紅花和山楂5種藥材制成。目前，已有文獻(xiàn)研究了葛根［4，9-10］、紅花［11-13］、三七［14-15］、川芎［16-18］和山楂［19-21］等藥材的活性成分，并有研究人員采用高效液相(HPLC)或高效毛細(xì)管電泳(HPCE)法建立了腦得生片中的葛根素的檢測(cè)方法［4，22-24］。但至今為止，鮮見同時(shí)鑒定腦得生片中多種成分的報(bào)道，導(dǎo)致該制劑的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)仍不明確，制約了其質(zhì)量的進(jìn)一步提升。

LC-ESI-MSn聯(lián)用技術(shù)擁有強(qiáng)大的分離能力，可有效分離中藥的復(fù)雜成分，進(jìn)而通過質(zhì)譜檢測(cè)器獲取其多級(jí)碎片信息，實(shí)現(xiàn)化合物的推斷鑒定，被認(rèn)為是中藥等復(fù)雜物質(zhì)體系的重要分析方法［25-28］。顯然，采用 LC-ESI-MSn聯(lián)用技術(shù)對(duì)中藥進(jìn)行定性分析，明確其化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)于進(jìn)一步開展藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究或提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有重要意義。為此，本研究采用HPLC-DADESI-MSn聯(lián)用技術(shù)建立腦得生片中多種成分同時(shí)鑒定方法，開展其化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑 Agilent 1100/LC/DAD/MS系統(tǒng)(安捷倫公司，美國(guó))，含在線真空脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、光電二極管陣列檢測(cè)器(DAD)、電噴霧接口(ESI)和Finnigan LCQ-DECA XP Plus離子阱質(zhì)譜儀(賽默飛公司，美國(guó))。Thermo Finnigan Xcalibur 1.3工作站。

實(shí)驗(yàn)試劑:乙腈(色譜純，默克公司，德國(guó))、甲醇和甲酸(分析純，杭州試劑公司，中國(guó))，以及 Milli-Q水(密理博公司，法國(guó))。葛根素、大豆苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb2和人參皂苷Rd對(duì)照品購于中國(guó)藥品生物制品檢定所，經(jīng)HPLC鑒定純度超過98%，甲醇溶液中穩(wěn)定。腦得生片由吉林春光制藥有限公司提供。藥材三七、川芎、葛根、紅花和山楂由杭州中藥材飲片廠提供。

1.2 樣品制備 腦得生片供試品的制備:取腦得生片1 g，去糖衣后，研成細(xì)粉，加甲醇-水溶液(體積比1∶1)20 ml，超聲提取 45 min，提取液過濾，濾液 12 000 r·min-1，離心 15 min，即得。

1.2.1 藥材供試品制備 原藥材粉末各取5 g，加水50 ml，加熱至 100℃，回流提取 2 次，每次1.5 h，每次50 ml，合并2次濾液。濾液在60℃條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干。殘?jiān)?0 ml的水溶解。溶液過0.45 μm濾膜，即得。

1.2.2 色譜條件 色譜柱:Agilent Zorbax SBC18柱(4.6 mm ×250 mm，i.d，5 μm)。流動(dòng)相:0.05%甲酸(A)和乙腈(B)，梯度洗脫 0 min，5%B;15 ～30 min，10%B;60 min，20%B;75 min，30%B;85 min，40%B;100 min，60%B。流速:0.5 ml·min-1。DAD 檢測(cè)器:190～400 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，同時(shí)選擇3個(gè)不同波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)，分別為203 nm、254 nm和280 nm。柱溫:40℃;進(jìn)樣體積:15μL。

1.2.3 質(zhì)譜檢測(cè)條件 MS同時(shí)記錄總離子流(TIC)色譜圖。離子極性:ESI(+/-);掃描范圍:100～2000;毛細(xì)管溫度:350℃;干燥氣(N2)流速:30 L·min-1，輔助氣體(N2)流速為10 L·min-1;毛細(xì)管電壓:20 V;裂解電壓:3.0 kV。離子寬度為2.0的母離子進(jìn)行多級(jí)質(zhì)譜分析。

2 數(shù)據(jù)分析

2.1 HPLC-DAD分析 根據(jù)中國(guó)藥典(2005版)對(duì)腦得生片生產(chǎn)過程的記載，腦得生片中的主要化學(xué)成分是由三七、葛根、紅花和山楂4種藥材的水溶性成分和川芎中的揮發(fā)油組成［8］。考慮到 HPLC-DAD-ESI-MSn聯(lián)用技術(shù)的特點(diǎn)，本研究暫不將揮發(fā)油作為研究對(duì)象。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，腦得生片中的主要化學(xué)成分是黃酮、皂苷和酚酸3類化學(xué)成分。文獻(xiàn)研究表明，三萜類皂苷的紫外最大吸收波長(zhǎng)在203 nm處［29-30］，酚酸的紫外最大吸收波長(zhǎng)在210 nm和280 nm處［31-32］，黃酮的紫外最大吸收波長(zhǎng)在250 nm和275 nm處［33-36］。因此，可以根據(jù)化合物的特征紫外吸收?qǐng)D快速推斷鑒定化合物的母核類型。

圖1為腦得生片色譜圖(圖1A-C)與三七提取物、葛根提取物、紅花提取物和山楂提取物的色譜圖進(jìn)行對(duì)照(圖1D-G)，腦得生片中的主要化合物色譜峰可以從各藥材提取物色譜峰中找到歸屬。

圖1 腦得生片及藥材在不同波長(zhǎng)下的HPLC-UV色譜圖Fig.1 HPLC-UV chromatogram of Naodesheng tablet and extracts of herbs

2.2 對(duì)照品的HPLC-MS分析 9個(gè)對(duì)照品直接進(jìn)樣用于ESI-MS參數(shù)優(yōu)化，葛根素、大豆苷、三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb2和人參皂苷Rd。標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過ESI離子源電離成碎片離子，相應(yīng)的碎片離子經(jīng)過碰撞、誘導(dǎo)及解離(CID)，獲取相應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)和多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。通過二級(jí)質(zhì)譜和多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)可以獲得9個(gè)對(duì)照品的裂解模式。這可以用于腦得生片中具有相似母核化合物的鑒定。在ESI電離過程中，所有對(duì)照品的準(zhǔn)分子離子峰是失去質(zhì)子的［M-H］-，三萜類皂苷的準(zhǔn)分子離子峰是加合AcO-離子后的加合離子［M+AcO］-。9個(gè)對(duì)照品的分子量、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)和多級(jí)質(zhì)譜獲得的主要裂解碎片見表1。

2.3 腦得生片HPLC-DAD-MSn分析 腦得生片的LC-MS數(shù)據(jù)用Matlab 7.0進(jìn)行噪音平滑處理。圖2為腦得生片203 nm波長(zhǎng)處的HPLCUV色譜圖(圖2A)和總離子流圖(圖2B)。

由于腦得生片總離子流圖的信噪比較低，很難將TIC色譜圖的組分或色譜峰與對(duì)照品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)照。為此，本研究先用CODA-DW法消除噪聲干擾［37］，濾噪后的總離子流圖見圖2C。

將腦得生片與藥材提取物的HPLC-UV和HPLC-MS色譜圖進(jìn)行對(duì)比，制劑中大多數(shù)的色譜峰可以在原藥材提取物的色譜圖中找到歸屬。10、16、28、29、30、36、38、39 和 41 號(hào)色譜峰可以通過色譜峰的保留時(shí)間、紫外吸收光譜圖和對(duì)照品的m/z值進(jìn)行鑒定。腦得生片化學(xué)物質(zhì)的推斷鑒定結(jié)果見表2。

圖2 腦得生片在203 nm處的HPLC-UV色譜圖和總離子流圖Fig.2 HPLC-UV chromatogram(203 nm)and total ion current chromatogram of Naodesheng tablet

表1 對(duì)照品一級(jí)質(zhì)譜和多級(jí)質(zhì)譜分析后的母離子和主要裂解離子Table 1 The precursor ion and main fragment ions of the reference compounds in MS and MSn analysis

表2 腦得生片中色譜峰HPLC-DAD-ESI-MS鑒定結(jié)果Table 2 HPLC-DAD-ESI-MS identification of Naodesheng tablet

續(xù)表2

由于缺少對(duì)照品，本研究通過各個(gè)色譜峰的特征紫外吸收?qǐng)D、一級(jí)質(zhì)譜、二級(jí)質(zhì)譜和三級(jí)質(zhì)譜的裂解碎片和前述9個(gè)對(duì)照品的各級(jí)質(zhì)譜裂解離子和裂解規(guī)律及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)來鑒定其它色譜峰［4，12，38-41］。

經(jīng)上述方法推斷鑒定，2、3、7、8、12、14、18、20、31、32和40號(hào)色譜峰分別為紅花黃色素A、4'-O-葡萄糖葛根素、3'-羥基葛根素、大豆苷元-8-C-芹菜糖基(1-6)葡萄糖苷、3'-甲氧基葛根素、3'-甲氧基-6″-O-木糖葛根素、5，7-三羥基異黃酮-7-糖苷、葛根苷A、大豆苷元、鷹嘴豆素A和人參皂苷Rb3(表2)。12號(hào)色譜峰的準(zhǔn)分子離子峰［M-H］-的m/z是445。據(jù)此推測(cè)12號(hào)色譜峰的分子質(zhì)量應(yīng)是446，與化合物3'-甲氧基葛根素的分子量相同。對(duì)該準(zhǔn)分子離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，產(chǎn)生脫去120 Da的碎片離子基峰，碎片離子的m/z為325(圖3)。這是碳苷類化合物的特征裂解途徑［39］。12號(hào)色譜峰的最大紫外吸收波長(zhǎng)在204 nm和250 nm。這些數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)相符［4，39］。據(jù)此推測(cè)12號(hào)色譜峰是3'-甲氧基葛根素。

32號(hào)色譜峰的準(zhǔn)分子離子峰［M-H］-的m/z是283。對(duì)此準(zhǔn)分子離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，產(chǎn)生缺失一個(gè)甲基的碎片離子基峰［M-H-15］-，碎片離子的m/z是268。這些數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［4］的信息一致，推測(cè)32號(hào)色譜峰是鷹嘴豆素A。

3號(hào)和14號(hào)色譜峰的準(zhǔn)分子離子峰［M+H］+的m/z是579。然而，2個(gè)色譜峰的質(zhì)譜裂解途徑不同。3號(hào)色譜峰的二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子基峰［M+H-162］+是缺失一個(gè)葡萄糖基獲得的，m/z是417;14號(hào)色譜峰的二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子基峰［M+H-132］+是缺失一個(gè)木糖基或芹菜糖基獲得的，碎片離子的m/z是447。2個(gè)色譜峰的三級(jí)質(zhì)譜顯示2個(gè)碎片離子基峰都缺失1個(gè)120 Da的中性片段，可以判斷這2個(gè)化合物是碳苷類化合物。將數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［39-40］進(jìn)行對(duì)照，3號(hào)色譜峰是4'-O-葡萄糖葛根素，14號(hào)色譜峰是3'-甲氧基-6″-O-木糖葛根素。

其它色譜峰，例如:4、17、23、24、25、26 和 42號(hào)色譜峰未從藥材提取物中找到對(duì)應(yīng)的色譜峰。這些色譜峰極有可能是在產(chǎn)品生產(chǎn)或是在樣品制備過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物。另外，藥廠實(shí)際生產(chǎn)時(shí)所用的藥材可能與實(shí)驗(yàn)中使用的有差異。由于母離子峰度較低，1、9、15、21、22、27、33、34、35、37和43號(hào)色譜峰的三級(jí)質(zhì)譜未得到很好檢測(cè)。由于缺少文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的驗(yàn)證，5、6和19號(hào)色譜峰無法鑒別。上述提到的色譜峰的m/z值、紫外吸收光譜圖和對(duì)應(yīng)的藥材和各色譜峰的數(shù)據(jù)見表2，已鑒定化合物的結(jié)構(gòu)式見圖4。

圖3 12號(hào)色譜峰的ESI圖Fig.3 ESI spectra of peak 12

圖4 腦得生片中已鑒定化合物的結(jié)構(gòu)式Fig.4 Structure of the identified compounds in Naodesheng tablet

3 結(jié)論

本研究運(yùn)用HPLC-DAD-ESI-MSn聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)和鑒定腦得生片中的化合物。根據(jù)化合物的保留時(shí)間，紫外吸收光譜圖和各級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，成功推斷鑒定了22個(gè)化合物，初步明確了腦得生片的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。這一研究結(jié)果為后續(xù)提高腦得生片質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，有助于開展其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

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