杜雪純，徐毅敏，季 申，毛秀紅，王 柯，王書(shū)芳

(1.浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310058;2.上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海 201203)

白芍為毛茛科植物芍藥(Paeonia lactiflora Pall.)的干燥根，具有補(bǔ)血調(diào)經(jīng)、養(yǎng)陰平肝、柔肝止痛、斂陰止汗之功效。研究表明，白芍還具有抗炎、抗病毒、解痙鎮(zhèn)痛、護(hù)肝等多種藥理活性［1-3］。然而，白芍生長(zhǎng)和儲(chǔ)存過(guò)程中易感染根腐病、銹病、灰霉病等，且易受地下蟲(chóng)害的侵害，而多菌靈、托布津等多種農(nóng)藥常被用于白芍的病蟲(chóng)害防治［4-6］，因此有可能造成白芍的農(nóng)藥殘留，而殘留的農(nóng)藥被人體吸收易產(chǎn)生嚴(yán)重危害。已有報(bào)道，采用氣相色譜法(GC)和高效液相色譜法(HPLC)來(lái)測(cè)定白芍中的有機(jī)氯、有機(jī)磷及除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥［7-13］。毛細(xì)管電泳(CE)方法因分析時(shí)間短，分離效率高，且對(duì)樣品和溶劑消耗量少，已越來(lái)越多地被用于中藥材中的農(nóng)藥殘留的測(cè)定［14］。GC法適用于檢測(cè)揮發(fā)性較好的農(nóng)藥。因GC、HPLC和CE方法分離原理及適用分析對(duì)象不同，三者在農(nóng)藥殘留分析方面可相互補(bǔ)充。采用質(zhì)譜(MS)檢測(cè)方法可提高CE分析靈敏度與選擇性，并能提供分析物的結(jié)構(gòu)信息［15］。因此，本研究擬建立白芍中19種有機(jī)氮類農(nóng)藥殘留的CE-MS檢測(cè)方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent G1601 HP3D毛細(xì)管電泳儀與單重四級(jí)桿HP Series 1100 MSD質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)通過(guò)CE-MS噴霧組件連接，質(zhì)譜接口為同軸鞘液接口(美國(guó)安捷倫科技公司)，鞘流液通過(guò)1100等梯度泵和1∶100分流器提供(美國(guó)安捷倫公司)。熔融石英毛細(xì)管柱70 cm ×50 μm(美國(guó) Polymicro Technologies公司)。數(shù)據(jù)處理使用安捷倫公司的工作站軟件完成。

1.2 試劑與藥材 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，純度均大于97.0%;乙腈、甲醇為色譜純(德國(guó)Merck公司);甲酸(美國(guó)TEDIA公司)為色譜純;無(wú)水硫酸鎂(美國(guó)Sigma公司，650℃干燥5 h，干燥器儲(chǔ)存)為分析純;Milli-Q純化水(美國(guó)Millipore公司);N-丙基乙二胺填料(PSA，美國(guó)Varian公司);50 ml離心管(墨西哥Corning公司)。24批白芍藥材分別購(gòu)自浙江省、河南省、四川省、吉林省和山西省，經(jīng)浙江大學(xué)藥學(xué)院陳柳蓉老師鑒定為毛茛科植物芍藥的根。

2 方法

2.1 供試品溶液制備 取干燥白芍藥材粉末(過(guò)孔徑200 μm 篩)5 g，精密稱定于50 ml離心管中，加入乙腈20 ml，無(wú)水 MgSO41 g，旋渦混合1 min，超聲提取20 min，20℃ 4 000 r/min離心10 min，取上清液;再加入10 ml乙腈至離心管中，重復(fù)上述操作。合并上清液后，加入60 mg PSA和180 mg無(wú)水MgSO4，旋渦混合1 min，20℃ 4 000 r/min 離心 10 min，取上清液，殘?jiān)偌? ml乙腈，重復(fù)上述操作。合并上清液，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，殘?jiān)?.5 ml甲醇溶解，20℃ 10 000 r/min高速離心10 min，取上清液，用于CE-MS分析。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的配制 準(zhǔn)確稱取19種農(nóng)藥對(duì)照品適量，分別置5 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，振搖，制得 0.204 mg·ml-1～2.74 mg·ml-1標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

2.3 CE-MS 條件

2.3.1 電泳條件 熔融石英毛細(xì)管柱70 cm×50 μm，運(yùn)行緩沖液為1%甲酸-15%甲醇水溶液(V/V);毛細(xì)管溫度為25℃，分離電壓為20 kV。毛細(xì)管首次使用時(shí)，依次用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液、水和運(yùn)行緩沖液各沖洗10 min。每次進(jìn)樣前用運(yùn)行緩沖液沖洗平衡5 min，并且每2次分析之間，毛細(xì)管依次用水沖洗1 min，0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液沖洗 2 min，水沖洗2 min。為保證良好的重現(xiàn)性，每3次分析之后換用新的緩沖液。壓力進(jìn)樣:50 mbar，進(jìn)樣時(shí)間20 s。

2.3.2 質(zhì)譜條件 90%甲醇-0.2%甲酸溶液為鞘液，流速為8μL·min-1;采用電噴霧離子化源(ESI)，正離子模式檢測(cè)。碎片離子電壓100 V，毛細(xì)管電壓為5 000 V。霧化氣體壓力5 psig，干燥氣體流速 6 L·min-1，干燥溫度250℃。選擇離子監(jiān)控模式(SIM)用于定量分析，用于定量分析的SIM離子見(jiàn)表1。

3 結(jié)果與討論

3.1 電泳條件優(yōu)化 預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，采用甲酸-甲醇的水溶液作為緩沖體系，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到基線分離，且峰形較好。在此基礎(chǔ)上分別對(duì)緩沖液中甲酸和甲醇含量進(jìn)行優(yōu)化。

3.1.1 緩沖液中甲酸含量 本實(shí)驗(yàn)考察了緩沖液中甲酸濃度變化(0.5% ～3.0%)對(duì)樣品分離的影響。結(jié)果表明，在其它條件不變的情況下，當(dāng)甲酸從0.5%到1%時(shí)，響應(yīng)逐漸增高且分離效果良好;但當(dāng)甲酸比例繼續(xù)增加時(shí)，響應(yīng)增高，分離度卻變差。綜合考慮被測(cè)物的分離度和響應(yīng)，選擇1%甲酸。

3.1.2 緩沖液中甲醇含量 本實(shí)驗(yàn)考察了緩沖液中甲醇濃度(5%、10%、15% 和20%)對(duì)分離效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)體系中含15%甲醇時(shí)，靈敏度最高，峰形最好，故選用含有15%甲醇的緩沖體系。

最終，本實(shí)驗(yàn)電泳緩沖液選擇1%甲酸-15%甲醇水溶液。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

3.2.1 鞘液組成及流速 本實(shí)驗(yàn)對(duì)鞘液中的甲醇及甲酸的濃度進(jìn)行優(yōu)化以獲得最佳分離效果和MS響應(yīng)。固定鞘液組成中甲酸濃度為0.1%，當(dāng)甲醇濃度改變?yōu)?0%時(shí)，峰形好，且響應(yīng)值較高。然后，對(duì)90%的甲醇-水鞘液中甲酸濃度進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，添加0.2%甲酸時(shí)，MS響應(yīng)值高。鞘液中甲醇比例對(duì)峰面積和峰高的影響見(jiàn)圖1。

實(shí)驗(yàn)同時(shí)還考察了鞘液流速對(duì)分離和響應(yīng)的影響，結(jié)果表明，當(dāng)鞘液流速為8μL·min-1時(shí)，樣品響應(yīng)與6μL·min-1時(shí)的樣品響應(yīng)相差不大，而分離度和峰形都明顯優(yōu)于6μL·min-1時(shí)，故最終選擇鞘液流速為8μL·min-1。

圖1 鞘液中甲醇濃度對(duì)峰高(A)和峰面積(B)的影響Fig.1 The effect of methanol concentration in sheath liquid on the peak height(A)and peak area(B)

3.2.2 其它質(zhì)譜參數(shù) 分別考察了噴霧氣壓力、干燥氣流速、干燥氣溫度、毛細(xì)管電壓和碎片離子電壓的影響，最后選擇噴霧氣壓力為5 psig，干燥氣流速為6 L·min-1，干燥氣溫度為250℃，毛細(xì)管電壓為5 000 V，碎片離子電壓為100 V。

3.3 線性關(guān)系考察 分別準(zhǔn)確量取19種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量，加甲醇稀釋成10個(gè)質(zhì)量濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液。在上述確定的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)樣測(cè)定，以定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(mg·L-1)為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸。各對(duì)照品的回歸方程及檢測(cè)限(LOD，S/N=3)見(jiàn)表1。混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液、加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的白芍樣品溶液和白芍空白樣品溶液的總離子流及選擇離子流電泳圖見(jiàn)圖2，除乙氧喹啉、螺環(huán)菌胺和滅菌唑因同分異構(gòu)體出現(xiàn)2個(gè)峰外，其它標(biāo)準(zhǔn)品均為單一色譜峰。

3.4 準(zhǔn)確度和重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積，19種農(nóng)藥峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.7% ～8.4%(n=6)，進(jìn)樣精密度良好。

精密稱取干燥白芍藥材粉末5 g，分別加入質(zhì)量濃度為 0.01 mg·kg-1和 0.10 mg·kg-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個(gè)添加水平平行6份，按“2.1”項(xiàng)下方法制備加樣回收率供試液，按“2.3”項(xiàng)下儀器條件進(jìn)行CE-MS分析，計(jì)算各農(nóng)藥回收率及RSD(表2)，以考察方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性。各農(nóng)藥的平均回收率為80.1%～108.4%，RSD ＜20%(除螺環(huán)菌胺為22.3%，乙氧喹啉為 29.2%外)。

3.5 樣本測(cè)定 精密稱取24批白芍藥材粉末各5 g，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，“2.3”項(xiàng)下儀器條件進(jìn)行分析，測(cè)定19種農(nóng)藥的殘留量，結(jié)果各產(chǎn)地白芍藥材均未檢測(cè)出農(nóng)藥。

表1 19種農(nóng)藥的線性結(jié)果和檢測(cè)限Table 1 The linearity results and LODs for 19 pesticides

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)品、加入混合標(biāo)準(zhǔn)品的白芍樣品和空白樣品溶液的總離子流及其選擇離子流電泳圖Fig.2 The typical TIC and EIC electropherograms of standards mixture，Paeoniae Radix Alba sample spiked with the 19 pesticides，and blank Paeoniae Radix Alba sample

表2 白芍中各農(nóng)藥的回收率Table 2 The recoveries of the 19 pesticides in Paeoniae Radix Alba matrix(n=6)

4 結(jié)論

本研究建立了白芍藥材中19種有機(jī)氮類農(nóng)藥殘留的CE-MS檢測(cè)方法。結(jié)果表明，該方法適用于白芍中有機(jī)氮類農(nóng)藥檢測(cè)，并可為其它中藥材中的有機(jī)氮類農(nóng)藥檢測(cè)提供參考。

［1］National Pharmacopoeia Committee(國(guó)家藥典委員會(huì)).Pharmacopoeia of People's Republic of China:version 2010(中華人民共和國(guó)藥典:2010版)［M］.Beijing:Chinese Medicine Science and Technology Press，2010:96.(in Chinese)

［2］HAN Lian-feng，LIU Fa(韓連鳳，劉 發(fā)).The analgesic effect of Paeoniae Radix Alba ［J］.Heilongjiang Medicine Journal(黑龍江醫(yī)藥)，2006，19(3):219.(in Chinese)

［3］LI Jin-qi，PENG Cheng，JI Jie-ying(李晉奇，彭成，姬 潔 瑩).Mechanism study of action on compatible using of total alkaloids of Radix Aconiti Praeparata and total glycosides or polysaccharides of Radix Paeoniae Alba therapy on rheumatoid arthritis in rats［J］.China Journal of Chinese Materia Medica(中國(guó)中藥雜志)，2009，34(22):2937-2942.(in Chinese)

［4］LU Ji-wei，MIAO Shui，MAO Xiu-hong，et al(陸繼偉，苗 水，毛秀紅，等).Solid phase extractiongas chromatography with dual tower and dual column for the simultaneous determination of 53 organophosphorus pesticides in traditional Chinese herbal medicines［J］.Chinese Traditional Patent Medicine(中成藥)，2010，32(1):94-99.(in Chinese)

［5］TENG Xue-mei(騰雪梅).Pollution-free cultivation techniques of Radix Paeoniae Alba［J］.Special Economic Animal and Plant(特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物)，2006，10:34.(in Chinese)

［6］GA Zang-zuo(尕藏措).The cultivation techniques of Radix Paeoniae Alba ［J］.Journal of Qinghai Agriculture and Animal Husbandry(青海農(nóng)牧業(yè))，2007，1:38.(in Chinese)

［7］ZHANG Li-ping，YANG Chun-qing，ZHAO Yonghua(張麗萍，楊春清，趙永華).Study on techniques for standardized cultivation and processing of Radix Paeoniae Alba and establishment of its SOP ［J］.World Science Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine(世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化)，2004，6(3):63-72，88-89.(in Chinese)

［8］SHEN Xu，CHEN Xiao-hui，GUO De-an，et al(沈旭，陳曉輝，果德安，等).Determination of 20 pesticide residues in Radix Paeoniae Alba by hollow fiber-based liquid phase microextraction coupled with gas chromatography ［J］.Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis(藥物分析雜志)，2009，29(10):1745-1748.(in Chinese)

［9］ZHANG Ya-li，XI Li-peng，YAN Zheng(張亞莉，習(xí)立鵬，閻 正).Determination organochlorine pesticide residues in paeonia lactiflra pall by capillary-gas chromatography ［J］.Journal of Hebei University of Science and Technology(河北科技大學(xué)學(xué)報(bào))，2005，26(4):275-276，333.(in Chinese)

［10］LI Yue-feng，YAN Xing-ke，LI Ting-li(李越峰，嚴(yán)興科，李廷利).Determination of pesticide residue of Radix Paeonia Alba by GC ［J］.Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine(四川中醫(yī))，2007，25(11):43-44.(in Chinese)

［11］GAO Qian，HUA Ri-mao，TANG Feng，et al(高倩，花日茂，湯 鋒，等).A multiresidue method for 31 Pesticides in Radix paeoniae Alba by GC［J］.Agrochemicals(農(nóng)藥)，2010，49(6):439-442.(in Chinese)

［12］LIU Yin，GONG Jing-ru，MAO Xiu-hong，et al(劉銀，龔婧如，毛秀紅，等).Determination of 23 pesticide residues in Paeoniae Radix Alba using high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry［J］.Chinese Journal of Pesticide Science(農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào))，2011，13(5):496-502.(in Chinese)

［13］WU Jia-lun，ZOU Yao-hua，LI Li-qing(吳加倫，鄒耀華，李麗青).Multi-residue analysis of fifteenorganochlorine and pyrethroid insecticides in Raidix Paeoniae Alba and Rhizoma coptidis［J］.Chinese Journal of Pesticide Science(農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào))，2006，8(1):65-70.(in Chinese)

［14］RODRIGUEZ-GONZALO E，RUANO-MIGUEL L，CARABIAS-MARTINEZ R.In-capillary microextraction using monolithic polymers:application to preconcentration of carbamate pesticides prior to their separation by MEKC ［J］.Electrophoresis，2009，30(11):1913-1922.

［15］HERNANDEZ-BORGES J， RODRIGUEZDELGADO M A，GARCIA-MONTELONGO F J，et al.Highly sensitive analysis of multiple pesticides in foods combining solid-phase microextraction，capillary electrophoresis-mass spectrometry，and chemometrics ［J］.Electrophoresis，2004，25(13):2065-2076.