程 玲，徐毅敏，季 申，冷 晶，毛秀紅，王 柯，王書芳

(1.浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310058;2.上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海 201203)

白芍是毛茛科植物芍藥(Paeonia lactiflora Pall.)的干燥根，具有平肝止痛，養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗的功效［1］。芍藥在生長過程中，易感染根腐病、銹病和灰霉病等，為減少病蟲害的侵襲會(huì)施以農(nóng)藥［2］。高倩等［3］在白芍中測(cè)到了毒死蜱、特丁硫磷及馬拉硫磷，沈旭等［4］在白芍中測(cè)到了七氯等8種有機(jī)氯農(nóng)藥。然而，在我國2010版《中國藥典》中僅規(guī)定了甘草和黃芪兩種藥物的六六六、滴滴涕、五氯硝基苯的限量標(biāo)準(zhǔn)，其它中藥材尚未涉及［5］。為嚴(yán)格控制白芍質(zhì)量，確保臨床安全用藥，進(jìn)行白芍中農(nóng)藥殘留分析十分重要。

氣相色譜中使用程序升溫蒸發(fā)(PTV)大體積進(jìn)樣(LVI)技術(shù)可以有效降低基質(zhì)干擾，提高靈敏度［6］。大體積進(jìn)樣-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LVI-GC-MS)在環(huán)境水［7］、水果［8］和蔬菜［9］等的有害殘留物分析中應(yīng)用廣泛。本研究使用LVI-GC-MS技術(shù)，分析了多個(gè)地區(qū)的白芍樣本，建立了測(cè)定白芍中有機(jī)磷、有機(jī)氯和擬除蟲菊酯等多種農(nóng)藥殘留的方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 6890N-5973N氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)配備自動(dòng)進(jìn)樣器和化學(xué)工作站;XW-80A Vortex渦旋混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);Centifuge 5810R離心機(jī)和Minispan AG22331離心機(jī)(德國 Eppendorf公司);R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BüCHI公司)。

1.2 試劑 乙腈、甲醇和正己烷(色譜純，德國Merck公司);N-丙基乙二胺填料(PSA，美國Varian公司);無水MgSO4(分析純，上海安譜科學(xué)儀器有限公司)在650℃干燥5 h后保存在干燥器中;Milli-Q超純水(美國Millipore公司);對(duì)照品:二甲戊樂靈(Pendimethalin)、甲基嘧啶磷(Pirimiphos-methyl)、腐霉利(Procymidone)、甲基立枯磷(Tolclofos-methyl)、蟲螨腈(Chlorfenapyr)、氯苯嘧啶醇(Fenarimol)、甲苯氟磺胺(Tolylfluanid)、順-氯丹(Cis-Chlordane)、聯(lián) 苯 菊 酯 (Bifenthrin)、氰 戊 菊 酯(Fenvalerate)、二氯苯醚菊酯(Permethrin)、滴滴滴(4，4'-DDD)、2，4'-DDE 和 4，4'-DDE 均購于美國Sigma-Aldrich公司(純度大于97.5%);百 菌 清 (Chlorothalonil)、甲 氰 菊 酯(Fenpropathrin)和殺螟硫磷(Fenitrothion)均購于德國 Dr Ehrenstorfer公司(純度大于96.0%)。

1.3 樣品 24批白芍樣品為山西、四川、安徽、河南和吉林等地市售產(chǎn)品，經(jīng)浙江大學(xué)藥學(xué)院陳柳蓉老師鑒定為毛茛科植物芍藥的根。

2 方法

2.1 儀器條件

2.1.1 色譜條件 DB-5MS毛細(xì)管柱(30 m ×250 μm，0.25 μm)，載氣為高純氮?dú)?純度≥99.999%);流速:1.0 ml/min，進(jìn)樣量:15μL。PTV進(jìn)樣口升溫程序:初始溫度40℃保持3 min，以 100℃/min升至 270℃保持 1 min。進(jìn)樣口溶劑排空條件:排空流量:60 ml/min，排空壓力:40 kPa，吹掃流速:10 ml/min，吹掃時(shí)間:6.8 min。色譜柱升溫程序:初始溫度40℃保持1 min，以 20℃ /min 升至 210℃ 保持 2 min，以5℃/min升至280℃保持22 min。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊源(EI)，電離電壓:70 eV;離子源溫度:230℃;四級(jí)桿溫度:150℃;質(zhì)譜檢測(cè)方式:選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)，檢測(cè)時(shí)間為5.0 ～47.5 min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制 準(zhǔn)確稱取17種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品適量，分別置于2 ml容量瓶中，大部分農(nóng)藥用甲醇溶解，個(gè)別有機(jī)氯類農(nóng)藥用正己烷溶解，各農(nóng)藥對(duì)照品儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度為500 μg/ml，4℃保存。取上述農(nóng)藥單標(biāo)儲(chǔ)備液適量，置于10 ml容量瓶中，用甲醇定容，配制成5 μg/ml的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

2.3 供試品溶液的制備 將白芍樣品粉碎，過孔徑200 μm的篩后，取5 g白芍樣品，精密稱定于50 ml聚丙烯離心管中，加入20 ml乙腈，渦旋1 min，超聲20 min，20℃ 4 000 r/min 離心10 min，取上清液;再加入10 ml乙腈至離心管中，重復(fù)上述操作。合并2次提取液，加入PSA 60 mg 和無水 MgSO4180 mg，渦旋 1 min，20℃4 000 r/min離心10 min，取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40℃旋干，殘?jiān)?.5 ml乙腈溶解、離心，取上清液用于GC-MS分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 PTV-LVI進(jìn)樣參數(shù)的優(yōu)化 為減少農(nóng)藥在進(jìn)樣口的損失，在合適的進(jìn)樣口升溫程序下，及時(shí)揮發(fā)溶劑并氣化農(nóng)藥進(jìn)入色譜柱。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分流排空流量(vent flow)、分流排空壓力(vent pres)和吹掃流量(purge flow)對(duì)農(nóng)藥的響應(yīng)影響明顯。

3.1.1 分流排空流量 分流排空流量對(duì)農(nóng)藥色譜峰的影響表現(xiàn)在，過小會(huì)使溶劑過多地進(jìn)入色譜柱，造成過載;過大會(huì)造成樣品的損失，尤其是不易揮發(fā)組分的損失。保持初始爐溫等其它條件不變，只改變分流排空流量(分別為20、30、40、50、60、70 ml/min)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多數(shù)化合物在分流排空流量由20 ml/min上升為60 ml/min時(shí)，響應(yīng)值逐漸提高;高于60 ml/min時(shí)，所有組分響應(yīng)明顯降低(圖1)。為了充分排空溶劑并且避免目標(biāo)物的損失，本實(shí)驗(yàn)選擇60 ml/min作為最佳分流排空流量。

圖1 分流排空流量對(duì)農(nóng)藥色譜峰面積的影響Fig.1 Effects of vent flow on peak area of the pesticides

3.1.2 分流排空壓力 分流排空流量為60 ml/min，其它參數(shù)不變，只改變分流排空壓力(分別為 0、10、20、30、40、50、60 kPa)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)化合物在分流排空壓力為40 kPa時(shí)響應(yīng)值最高，高于或低于40 kPa都明顯下降(圖2)。為了更好地排除溶劑，防止大量溶劑進(jìn)入色譜柱，本實(shí)驗(yàn)選擇40 kPa作為作為分流排空壓力。

圖2 分流排空壓力對(duì)農(nóng)藥色譜峰面積的影響Fig.2 Effects of vent pres on peak area of the pesticides

3.1.3 吹掃流量 維持分流排空流量60 ml/min，分流排空壓力40 kPa，其它參數(shù)不變，僅改變吹掃流量(分別為 5、10、15和 20 ml/min)，考察吹掃流量對(duì)目標(biāo)分析物響應(yīng)值的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在吹掃流量為10 ml/min時(shí)所有目標(biāo)分析物的響應(yīng)值達(dá)到最高，當(dāng)高于15 ml/min時(shí)明顯下降(圖3)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇10 ml/min作為吹掃流量。

圖3 吹掃流速對(duì)農(nóng)藥色譜峰面積的影響Fig.3 Effects of purge flow on peak area of the pesticides

綜上，PTV-LVI的條件是分流排空流量60 ml/min，分流排空壓力40 kPa，吹掃流量10 ml/min。

3.2 線性關(guān)系及檢測(cè)限考察 取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，配制質(zhì)量濃度為 0.006、0.01、0.02、0.1、0.2、0.4、1.0、1.6 和 2.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液，在上述確定的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)樣測(cè)定，以定量離子的峰面積對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表1?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品溶液的總離子流色譜圖見圖1，除二氯苯迷菊酯和氰戊菊酯因同分異構(gòu)體出現(xiàn)2個(gè)峰外，其它標(biāo)準(zhǔn)品均為單一色譜峰。由于白芍樣本基質(zhì)對(duì)百菌清和殺螟硫磷的測(cè)定有干擾，所以未對(duì)其進(jìn)行定量分析。

取適量15種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液(0.1 μg/ml)加入到白芍粉末中，平行6份，按照2.1和2.3節(jié)進(jìn)行樣品處理和分析，將信噪比S/N=3時(shí)的農(nóng)藥質(zhì)量濃度確定為該分析方法中各農(nóng)藥的檢測(cè)限(LOD)，將信噪比S/N=10時(shí)的農(nóng)藥質(zhì)量濃度確定為該分析方法中各農(nóng)藥的定量限(LOQ)，結(jié)果見表1。

表1 15種農(nóng)藥的保留時(shí)間和特征離子，線性方程及其相關(guān)系數(shù)Table 1 Retention times，characteristic ions，linear equations and correlation coefficients for 15 pesticides

圖4 17個(gè)農(nóng)藥混合對(duì)照品總離子色譜流圖Fig.4 Total ion current chromatogram of 17 pesticides mixture solution

3.3 加樣回收率及重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取5 g白芍藥材，分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備成含有10、100 μg/kg農(nóng)藥的樣品，每個(gè)添加水平平行6份，按照2.1和2.3節(jié)進(jìn)行樣品處理和分析，計(jì)算各農(nóng)藥回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，以考察方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性，結(jié)果見表2。除二甲戊樂靈和 4，4'-DDE 為 53.1%、45.2%外，其余農(nóng)藥的平均回收率為 60.4% ～106.8%，RSD≤18.6%。

表2 白芍中各農(nóng)藥的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 The recoveries and RSD of 15 pesticides at two spiked levels in Radix Paeoniae Alba

3.4 樣品測(cè)定 取24份不同產(chǎn)地的白芍粉末，按照2.1、2.3節(jié)進(jìn)行樣品處理和分析，其中四川、安徽、河南和吉林等地的白芍均未檢出農(nóng)藥，山西產(chǎn)2批白芍中檢出了4，4'-DDE(分別為(4.46 ±0.42)μg/kg、(4.21 ±0.27)μg/kg。

本研究建立的方法靈敏度高，操作簡便，成本低，經(jīng)過方法學(xué)的驗(yàn)證，可以有效實(shí)現(xiàn)白芍中15種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。

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