李文龍，張文明，薛東升，陳 俊，瞿海斌

(1.浙江大學(xué)藥物信息學(xué)研究所，浙江 杭州 310058;2.上海凱寶藥業(yè)有限公司，上海 201418)

中藥成分的復(fù)雜性決定了必須采用多成分含量測定、多指標(biāo)質(zhì)量評價的模式對其進(jìn)行質(zhì)量控制，建立這種分析方法需要有多種對照品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，但是部分中藥標(biāo)準(zhǔn)品存在分離難度大、單體不穩(wěn)定、難以供應(yīng)或供應(yīng)價格高等問題，使得該模式僅限于少數(shù)科研項(xiàng)目，而難以推廣到工業(yè)生產(chǎn)上。為解決這一問題，王智民等［1-3］提出，通過測定一個易得對照品成分的含量，求出其它藥效成分對應(yīng)于這一標(biāo)準(zhǔn)品的校正因子，來實(shí)現(xiàn)多個成分的“一測多評法”，尤其是對照品匱乏成分的測定。該方法可實(shí)現(xiàn)在對照品短缺的情況下，進(jìn)行多指標(biāo)成分的含量測定。此法經(jīng)實(shí)踐驗(yàn)證，具有可行性和技術(shù)適應(yīng)性，已被采納錄入2010版《中國藥典》［4］，目前有白芍、黃芩等藥材［5-12］以及喜炎平、冠脈康膠囊等中成藥［13-14］的相關(guān)研究報(bào)道。

金銀花(Lonicerae Japonicae Flos.)為忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb)的干燥花蕾或帶初開的花，味甘、性寒，為常用中藥，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效。有機(jī)酸類化合物是金銀花的主要有效成分，包括咖啡酸(CfA)、綠原酸(CA)、新綠原酸(NCA)和異綠原酸等，其中異綠原酸為一種混合物，它的異構(gòu)體有6種，分別為 4，5-二咖啡酸?？崴?4，5-DCA)、3，4-二咖啡酸?？崴?3，4-DCA)、3，5-二咖啡酸?？崴?3，5-DCA)、l，3-二咖啡酸酰奎尼酸、3-阿魏酰壘尼酸和 4-阿魏酰奎尼酸［15］。除綠原酸和咖啡酸外，其余標(biāo)準(zhǔn)品由于分離純化比較困難，價格昂貴，難以應(yīng)用到常規(guī)分析中。本研究以金銀花藥材為例，通過對其中CA和CfA含量的測定，實(shí)現(xiàn)了對其它4種有機(jī)酸類化合物(NCA、3，4-DCA、4，5-DCA、3，5-DCA)的含量測定，效果較為滿意。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司);MILLIPORE超純水器(美國Millipore公司);KQ-250B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);METTLER AE240電子天平(梅特勒-托利多公司);FL-027高速臺式離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。

1.2 試藥 實(shí)驗(yàn)用乙腈、甲酸均為色譜純，水為超純水。CA、CfA對照品購自中國藥品生物制品檢定所，NCA、3，4-DCA、3，5-DCA、4，5-DCA由本實(shí)驗(yàn)室自制，純度均＞95%。金銀花藥材樣品由上海凱寶藥業(yè)有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

成分的濃度與檢測器響應(yīng)在一定的范圍內(nèi)成正比，即f=W/A(其中，W 表示濃度，A表示響應(yīng)值)。本研究在金銀花的多指標(biāo)含量測定時，分別以綠原酸和咖啡酸為參照物，計(jì)算其它成分的相對校正因子。在實(shí)際測定時，用外標(biāo)法測定綠原酸或咖啡酸，再通過校正因子計(jì)算其它化學(xué)成分的含量。同時，用常規(guī)方法進(jìn)行同步測定，以驗(yàn)證計(jì)算值的正確性和可行性。相對校正因子的計(jì)算方法［7］:

其中:s，k分別代表內(nèi)參物和其它待測成分。

2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX SBC18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)。流動相:A 相為0.1%甲酸-水，B 相為 0.1% 甲酸-乙腈，采用二元梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?～25 min，B相:8%～8%;25～30 min，B相:8% ～19%;30～60 min，B相:19% ～19%。另外，流速:1 ml·min-1，檢測波長:280 nm，柱溫:25℃，進(jìn)樣量:10μL。在此色譜條件下，所得混合標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖如圖1所示。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品(A)及金銀花藥材提取液(B)的HPLC色譜圖Fig.1 The characteristic chromatograms of the mixed standards(A)and sample solution(B)

2.2 對照品溶液制備 精密稱取 CA、CfA、NCA、3，4-DCA、4，5-DCA、3，5-DCA 標(biāo)準(zhǔn)品適量，用50%的甲醇配制成單個標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，分別精密量取各儲備液適量，配制成混和標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，并稀釋成系列濃度的混和標(biāo)準(zhǔn)品。以上6種有機(jī)酸在混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液中的質(zhì)量濃度分別為 0.960、1.05、0.975、0.435、0.945、0.870 mg·ml-1。

2.3 供試品溶液制備 精密稱取1 g金銀花藥材粉末置于25 ml容量瓶中，用50∶50的甲醇:水定容至刻度，超聲提取2 h，取提取液1 ml，在 10 000 r/min 下離心 10 min，取 10μL上清液用于液相分析。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 在線性范圍內(nèi)，分別進(jìn)行日內(nèi)精密度(1 d內(nèi)連續(xù)分析6次)和日間精密度(3 d內(nèi)每天分析1次)的考察。結(jié)果表明，6種有機(jī)酸的日內(nèi)精密度RSD均＜3%，日間精密度RSD均＜5%。表明該方法具有滿意的精密度。

2.5 重復(fù)性考察 精密稱取同一批次金銀花藥材粉末6份，按照2.3項(xiàng)下的方法進(jìn)行提取，提取液依次進(jìn)行HPLC分析。在該色譜條件下，各有機(jī)酸類成分的重復(fù)性RSD均＜5%(表1)，表明該定量方法的重復(fù)性良好。

表1 重復(fù)性考察結(jié)果Table 1 The repeatability parameters of the established HPLC method

2.6 穩(wěn)定性考察 將供試品溶液置于室溫下，分別在0、2、4、8、16、24 h 后進(jìn)樣分析，結(jié)果見表2。在該色譜條件下，各有機(jī)酸類成分的穩(wěn)定性RSD均＜5%，表明在24 h以內(nèi)，各有機(jī)酸類成分在溶液中的含量穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率考察 按加樣回收率的測定方法，在已知含量的供試品溶液中，加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣分析，平行制備6份，計(jì)算平均回收率，6種有機(jī)酸的平均回收率分別為:97.7%、102%、99.1%、98.6%、101%、98.5%，表明在該色譜條件下，該定量方法的加樣回收率良好。

2.8 相對校正因子計(jì)算 對不同進(jìn)樣體積的混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，分別以綠原酸和咖啡酸為參照物，按2.1項(xiàng)下公式計(jì)算出其它目標(biāo)化合物的相對校正因子，結(jié)果見表3。

表2 穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 2 The stability parameters of the established HPLC method

表3 相對校正因子計(jì)算結(jié)果Table 3 The computing results of the relative correction factors

2.9 校正因子重現(xiàn)性考察 試驗(yàn)分別考察了Waters和Agilent 1100兩種高效液相色譜系統(tǒng)和 Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)、Alltech Alltima-C18(250 mm × 4.6 mm，5μm)和 Tigerkin C18(200 mm × 4.6 mm，5.0 μm)三種色譜柱。精密吸取混合對照品溶液5、10、15 和 20μL進(jìn)樣分析，每個濃度進(jìn)樣 3次，取平均值。以綠原酸為參照物計(jì)算相對校正因子，所得的相對校正因子及其相對標(biāo)準(zhǔn)差。表4顯示，不同的儀器及不同的色譜柱所得的相對校正因子差異并不顯著。在浙江大學(xué)藥物信息學(xué)研究所(實(shí)驗(yàn)室1)和上海凱寶藥業(yè)股份有限公司化驗(yàn)室(實(shí)驗(yàn)室2)均采用 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱進(jìn)行一測多評試驗(yàn)，進(jìn)樣量為10μL，各測3次，測得的相對校正因子見表5，RSD在0.8% ～3.8%之間，這表明不同實(shí)驗(yàn)室所測得的相對校正因子差異較小。

表4 不同儀器和不同色譜柱上測得的相對校正因子Table 4 The relative correction factors calculated with different HPLC instruments and chromatographic columns

表5 不同實(shí)驗(yàn)室測得的相對校正因子Table 5 The relative correction factors determined in different laboratories

2.10 一測多評法與外標(biāo)法的比較結(jié)果 分別以綠原酸和咖啡酸為內(nèi)參物質(zhì)，用所建立的一測多評法測定了金銀花藥材中其他有機(jī)酸的含量，并用外標(biāo)法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果列于表6中。對測試結(jié)果進(jìn)行方差分析，得到 NCA、3，4-DCA、3，5-DCA、4，5-DCA 對應(yīng)的 P 值分別為1.000、0.798、1.000、0.998，表明一測多評法與外標(biāo)法測定結(jié)果之間不存在顯著性差異。

表6 采用一測多評法與外標(biāo)法測得的金銀花藥材的含量平均值Table 6 The average content values of the Lonicerae Japonicae Flos samples via QAMS and external standard method

綜上所述，在對照品缺乏的情況下，以外標(biāo)法測定CA或CfA，利用相對校正因子實(shí)現(xiàn)對金銀花藥材中其它有機(jī)酸的含量測定是可行的。該類方法可大大降低分析成本，提高工作效率，將其收入藥典，符合質(zhì)量可控的目標(biāo)性原則、準(zhǔn)確靈敏的科學(xué)性原則和簡便實(shí)用的合理性原則。目前2010版中國藥典中僅有黃連藥材的質(zhì)量控制采用這一方法，期望在下一版藥典中能有更多的藥材采用這一方法進(jìn)行質(zhì)量控制。

［1］WANG Zhi-min，GAO Hui-min，F(xiàn)U Xue-tao，et al(王智民，高慧敏，付雪濤，等).Multi-components quantitation by one marker new method for quality evaluation of Chinese herbal medicine［J］.Chin J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2006，31(23):1925-1928.(in Chinese)

［2］WANG Zhi-min，QIAN Zhong-zhi，ZHANG Qi-wei，et al(王智民，錢忠直，張啟偉，等).Technical guide for the establishment of QMAS methods［J］.Chin J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2011，36(6):657-658.(in Chinese)

［3］KUANG Yan-hui，ZHU Jing-jing，WANG Zhi-min，et al(匡艷輝，朱晶晶，王智民，等).Simultaneous quantitative analysis of five alkaloids in rhizoma of coptis chinensis by multi-components assay by single marker［J］.Chin Pharm J(中國藥學(xué)雜志)，2009，44(5):390-394.(in Chinese)

［4］Pharmacopoeia of the peoples republic of China，part 1(中華人民共和國藥典，一部)［M］.2010，285-286.(in Chinese)

［5］HUANG Shan-jun，YANG Qi-wei，SHI Yan-hong，et al(黃山君，楊琪偉，石燕紅，等).Simultaneous assay of paeoniflorin and albiflorin in Paeoniae Radix Alba by QAMS ［J］.Chin J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2011，36(6):780-783.(in Chinese)

［6］ZHU Jing-jing，WANG Zhi-min，ZHANG Qi-wei，et al(朱晶晶，王智民，張啟偉，等).A quantitative method for simultaneous assay of four flavones with one marker in Radix Scutellar iae ［J］.Chin J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2009，34(24):3229-3234.(in Chinese)

［7］ZHU Jing-jing，WANG Zhi-min，KUANG Yan-hui，et al(朱晶晶，王智民，匡艷輝，等).quantitative method using one marker for simultaneous assay of ginsenosides in Panax ginseng and P.notoginseng［J］.Acta Pharm Sin(藥學(xué)學(xué)報(bào))，2008，43(12):1211-1216.(in Chinese)

［8］HUANG Shuai，MA Miao，HUANG Qian-qian，et al(黃 帥，馬 淼，黃倩倩，等).Simultaneous assay of 3 saponins in Radix bupleuri by QAMS［J］.Lishizhen Med Mater Med Res(時珍國醫(yī)國藥)，2010，21(4):838-840.(in Chinese)

［9］CAI Hai-xia，CHEN Jun，LI Ping(蔡海霞，陳 君，李 萍).Simultaneous assay of four isoflavonoids in Astragali Radix by QAMS ［J］.Chin J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2010，35(20):2712-2717.(in Chinese)

［10］YU Xiao，SONG Jing，XIONG Zhi-li，et al(于霄，宋 靜，熊志立，等).Simultaneous assay of epimedin A epimedin B，epimedin C and icariin in herba epimedii by QAMS ［J］.Chin J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2010，35(24):3310-3313.(in Chinese)

［11］KONG Jing-jing，ZHU Jing-jing，WANG Zhi-min，et al(孔晶晶，朱晶晶，王智民，等).Quantitative analysis of polytype components in forsythia suspense by QAMS method ［J］.Chin Pharm J(中國藥學(xué)雜志)，2010，45(17):1301-1304.(in Chinese)

［12］SONG Ya-fang，WANG Zhi-min，ZHU Jing-jing，et al(宋亞芳，王智民，朱晶晶，等).Assay of evodin，evodiamine and rutaecarpine in fructus evodiae by QAMS［J］.Chin J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2009，34(21):2781-2785.(in Chinese)

［13］ZOU Xiao-Li，YU Cui-cui，XU Hui，et al(鄒曉麗，于翠翠，許 卉，等).Study of a potency value transmission method for reference standard of andrographolide sulfonate E in Xiyanping injection［J］.Chin J Pharm Anal(藥物分析雜志)，2010，30(1):134-137.(in Chinese)

［14］ZOU Gui-xin，YOU Xian-min，ZHANG Ying，et al(鄒桂欣，尤獻(xiàn)民，張 穎，等).New method of multi-componen ts quantita tion by one marker new method for quality evaluation of Guanmaikang capsula［J］.Chin J Chin Mater Med(中國中藥雜 志)，2008，33(15):1828-1831.(in Chinese)

［15］LIU Xiang-lan，LIU Fang，ZHANG Ying，et al(劉祥蘭，劉 芳，張 英，等).Study on different extraction process of chlorogenic acid in flos lonicerae and optimum ［J］.Chin Tradit Pat Med(中成藥)，2000，22(6):402-404.(in Chinese)