何 敏 劉水紅 楊志強(qiáng) 高志增

骨肉瘤是原發(fā)性骨惡性腫瘤中最常見的一種，約占骨惡性腫瘤的1/3。其惡性程度較高，是嚴(yán)重影響勞動(dòng)生產(chǎn)力并危及生命的重要腫瘤之一，早期診斷及早期治療具有特別重要的意義[1]。MicroRNAs（miRNAs）是內(nèi)源性非編碼RNA經(jīng)過一系列加工后產(chǎn)生的一類大小約20～25個(gè)核苷酸單鏈的小分子RNA，其功能為調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)[2]。在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中，miRNAs扮演著“癌基因”和（或）“抑癌基因”的重要角色[3-5]。本研究擬采用TaqMan MGB探針法檢測(cè)miR-93在骨肉瘤組織中的表達(dá)情況，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-93過表達(dá)載體及利用反義技術(shù)降低骨肉瘤細(xì)胞miR-93的表達(dá)，觀察其生長(zhǎng)及細(xì)胞周期變化情況，以便為骨肉瘤早期診治提供新的理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 收集2009年9月—2011年11月南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨外科38例骨肉瘤及對(duì)應(yīng)軟骨組織手術(shù)標(biāo)本，所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，其中男25例，女13例，年齡11～47歲。

1.2 試劑和儀器 TaqMan miRNA分析試劑盒（美國(guó)ABI公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）、胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司）、脂質(zhì)體 LipfectamineTM2000及真核載體pcDNA5-FRT（美國(guó)Invitrogen公司）；反義miR-93寡核苷酸（AMO-miR-93，大連寶生物公司）；人骨肉瘤細(xì)胞系 U2-OS和MG-63購自上海中科院細(xì)胞庫；實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀7500（美國(guó)ABI公司)，流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-93的表達(dá) 采用Trizol試劑提取組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，-70℃保存?zhèn)溆茫胢iR-93檢測(cè)試劑盒檢測(cè)miR-93的表達(dá)。首先取2μg總RNA作為模板與3μL逆轉(zhuǎn)錄酶混合，在20μL反應(yīng)體系中，16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。收集cDNA，然后將cDNA 150倍稀釋，取1μL稀釋的cDNA與2μLTaqMan引物混合，20μL反應(yīng)體系：95℃ 10 min，隨后 95 ℃ 15 s，61℃ 60 s，40 個(gè)循環(huán)。相對(duì) miRNA 表達(dá)水平用循環(huán)閾值（Ct值）準(zhǔn)確計(jì)算，U6小核RNA為內(nèi)參。

1.3.2 miR-93過表達(dá)載體的構(gòu)建 利用人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS的cDNA擴(kuò)增出miR-93前體序列，miR-93上游引物：5′-AGTCTCTGGCTGACTACATCACAG-3′；下游引物 ：5′-CTACTCACAAAACAGGAGTGGAATC-3′。PCR產(chǎn)物純化后，用Bam HⅠ和XhoⅠ對(duì)產(chǎn)物及載體pcDNA5-FRT雙酶切。酶切產(chǎn)物純化后用T4連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α。轉(zhuǎn)化菌涂布于含氨芐青霉素抗性的溶菌肉湯培養(yǎng)基（LB固體培養(yǎng)基）瓊脂平皿涂板，倒置平皿，于37℃中培養(yǎng)16 h。挑取單菌落搖菌，質(zhì)粒小提，送公司測(cè)序驗(yàn)證，選取構(gòu)建正確的質(zhì)粒。

1.3.3 反義miR-93單核苷酸序列設(shè)計(jì) 根據(jù)miRBase提供的 miRNA基因序列（http://www.sanger.ac.uk/software/Rfam/miRna），獲取人miR-93序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的反義寡核苷酸序，采用核酸序列數(shù)據(jù)庫檢索程序排除其他的可能同源序列。同時(shí)再確定 1條隨機(jī)的對(duì)照序列。miR-93反義序列：5′-CTACCTGCACGAACAGCACTTT-3′。隨機(jī)上游序列 ：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；隨機(jī)下游序列 ：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′，提交大連寶生物公司合成，純化，全硫代修飾。

1.3.4 細(xì)胞株的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 U2-OS和MG-63細(xì)胞株接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。嚴(yán)格按照脂質(zhì)體LipfectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，反義miR-93寡核苷酸終濃度分別為：50、100、150、200 nmol/L，初步篩選出最佳終濃度為100 nmol/L。

1.3.5 轉(zhuǎn)染miR-93過表達(dá)載體及反義miR-93單核苷酸后對(duì)miR-93表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、隨機(jī)對(duì)照組、過表達(dá)組及AMO-miR-93組。后2組分別轉(zhuǎn)染miR-93過表達(dá)載體及反義miR-93單核苷酸48 h后，抽提總RNA經(jīng)純度分析，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，測(cè)定cDNA濃度。用miR-93檢測(cè)試劑盒檢測(cè)miR-93的表達(dá)（具體條件同上）。

1.3.6 MTT檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖 收集U2-OS和MG-63細(xì)胞，在離心管內(nèi)將各組細(xì)胞懸液充分打勻，按1×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加液量200μL，24 h后換液。實(shí)驗(yàn)分組同1.3.5，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。于轉(zhuǎn)染后1～3 d每孔加入5 g/L MTT試劑20μL，于37℃，5%CO2條件下繼續(xù)孵育4 h。吸取各孔上清，加入DMSO 150μL/孔，室溫下置水平搖床搖10 min以充分溶解MTT結(jié)晶。在酶聯(lián)免疫測(cè)定儀上選擇波長(zhǎng)490 nm，空白孔調(diào)零，測(cè)定各孔光密度（OD）值。每組重復(fù)3次。按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）：

1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期變化情況 實(shí)驗(yàn)分組同1.3.5。細(xì)胞接種6孔板，分別轉(zhuǎn)染miR-93過表達(dá)載體及反義miR-93單核苷酸48 h后收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，PBS洗2次，離心，棄上清，加PBS重懸細(xì)胞，加-20℃預(yù)冷的75%乙醇并振蕩，4℃固定1 h，離心，棄冰乙醇，PBS洗1遍，棄上清；加入含有50 mg/L碘化吡啶（PI）和100 mg/L無DNA酶污染的RNA酶PBS染色液，4℃避光靜置1 h，上機(jī)檢測(cè)。每組重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤組織miR-93的表達(dá)情況 在38例骨肉瘤及對(duì)應(yīng)軟骨組織中65.8%（25/38）骨肉瘤組織miR-93的表達(dá)明顯高于相對(duì)應(yīng)的軟骨組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.76，P<0.05），見圖1。

Figure 1 The expression of miR-93 in osteosarcoma and cartilaginous tissues圖1 骨肉瘤組織及軟骨組織中miR-93的表達(dá)情況

2.2 miR-93過表達(dá)載體或AMO-miR-93轉(zhuǎn)染后miR-93表達(dá) 過表達(dá)組U2-OS和MG-63中miR-93表達(dá)水平較空白對(duì)照組增高 （P<0.01）；AMO-miR-93組中miR-93表達(dá)較空白對(duì)照組降低 （P<0.01），而空白對(duì)照組與隨機(jī)對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.3 miR-93過表達(dá)載體或AMO-miR-93作用后對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 轉(zhuǎn)然后1～3d，過表達(dá)組骨肉瘤細(xì)胞U2-OS和MG-63的增殖明顯快于空白對(duì)照組，而AMO-miR-93組骨肉瘤細(xì)胞的增殖明顯慢于空白對(duì)照組（P<0.01）；空白對(duì)照組與隨機(jī)對(duì)照組間骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2、3。

Table 1 The expression of miR-93 in U2-OSand MG-63 cells treated with different conditions表1 不同因素處理U2-OS和MG-63細(xì)胞后miR-93表達(dá)情況 （n=3，±s）

Table 1 The expression of miR-93 in U2-OSand MG-63 cells treated with different conditions表1 不同因素處理U2-OS和MG-63細(xì)胞后miR-93表達(dá)情況 （n=3，±s）

**P<0.01

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Table 2 The optical density of cell proliferation in different treated U2-OScells表2 不同因素處理U2-OS細(xì)胞后增殖率OD值（n=3，±s）

Table 2 The optical density of cell proliferation in different treated U2-OScells表2 不同因素處理U2-OS細(xì)胞后增殖率OD值（n=3，±s）

**P<0.01

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Table 3 The optical density of cell proliferation in different treated MG-63 cells表3 不同因素處理MG-63細(xì)胞后增殖率OD值（n=3，±s）

Table 3 The optical density of cell proliferation in different treated MG-63 cells表3 不同因素處理MG-63細(xì)胞后增殖率OD值（n=3，±s）

**P<0.01

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2.4 轉(zhuǎn)染miR-93過表達(dá)載體或AMO-miR-93后骨肉瘤細(xì)胞周期變化情況 過表達(dá)組較空白對(duì)照組U2-OS和MG-63細(xì)胞的G0/G1期比例明顯降低，而S期的細(xì)胞比例明顯增加（P<0.01）；AMO-miR-93組較空白對(duì)照組細(xì)胞G0/G1期比例明顯增加，而S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯降低（P<0.01）?？瞻讓?duì)照組與隨機(jī)對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表4、5。

Table 4 The cell cycle of U2-OScells in four groups表4 4組U2-OS細(xì)胞的細(xì)胞周期變化 （n=3，%，±s）

Table 4 The cell cycle of U2-OScells in four groups表4 4組U2-OS細(xì)胞的細(xì)胞周期變化 （n=3，%，±s）

**P<0.01

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Table 5 The cell cycle of MG-63 cells in four groups表5 4組MG-63細(xì)胞的細(xì)胞周期變化 （n=3，%，±s）

Table 5 The cell cycle of MG-63 cells in four groups表5 4組MG-63細(xì)胞的細(xì)胞周期變化 （n=3，%，±s）

**P<0.01

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3 討論

miRNAs可通過調(diào)控基因表達(dá)來參與生命過程中的一系列重要進(jìn)程，包括早期發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡、分化以及死亡。miRNAs通過與靶mRNA的3′非編碼區(qū)近乎完全互補(bǔ)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平使其降解，或者與之不完全互補(bǔ)結(jié)合在翻譯水平抑制蛋白合成，從而在基因表達(dá)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。多種癌癥中存在miRNAs的突變或表達(dá)異常，其在腫瘤發(fā)生中的角色正日益受到關(guān)注[6-7]。有研究者認(rèn)為miRNAs可作為癌基因或者抑癌基因而發(fā)揮作用[5-6]。因此miRNAs可能成為腫瘤診斷、治療及判斷預(yù)后的新的分子標(biāo)志物和分子靶點(diǎn)，且由于miRNAs在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)，這將更有利于腫瘤的早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療，必將具有廣泛的臨床應(yīng)用前景[8-9]。

骨肉瘤是起源于成骨組織的一種原發(fā)性惡性腫瘤，目前主要采用術(shù)前術(shù)后放療聯(lián)合外科手術(shù)的綜合療法。雖然化療和手術(shù)治療的水平不斷提高，但仍然有大約一半的患者治療失敗，原因就在于腫瘤的早期轉(zhuǎn)移以及耐藥性的出現(xiàn)[1,8]。因此，迫切需要尋找新的腫瘤標(biāo)志物來進(jìn)一步提高骨肉瘤的早期診療水平。Murakami等[10-11]首次研究發(fā)現(xiàn)miR-93在肝癌組織中呈過高表達(dá)，最近又有研究發(fā)現(xiàn)miR-93通過調(diào)控integrin-β8而參調(diào)節(jié)腫瘤的生長(zhǎng)[12]，但miR-93在骨肉瘤中的表達(dá)及其作用目前還不清楚。

筆者首先通過分析38例骨肉瘤組織及對(duì)應(yīng)的軟骨組織中miR-93的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)65.8%的骨肉瘤患者癌組織中miR-93表達(dá)上調(diào)。將miR-93過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入骨肉瘤細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)明顯增高。Krützfeldt等[13]研究發(fā)現(xiàn)針對(duì) miRNA122及miRNA192的反義寡核苷酸能夠明顯抑制小鼠不同組織中對(duì)應(yīng)miRNAs的表達(dá)，表明針對(duì)miRNAs的反義寡核苷酸可以有效抑制miRNAs的表達(dá)。本研究同樣利用反義技術(shù)成功降低骨肉瘤細(xì)胞U2-OS和MG-63內(nèi)的miR-93表達(dá)。同時(shí)筆者利用MTT法檢測(cè)證實(shí)miR-93可以抑制骨肉瘤細(xì)胞U2-OS和MG-63的增殖。流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)增加miR-93表達(dá)后骨肉瘤細(xì)胞G0/G1期降低，阻滯于S期；降低miR-93表達(dá)后骨肉瘤細(xì)胞周期主要停滯在 G0/G1期，而S期和G2/M期細(xì)胞的比例明顯下降。另外在胃癌中的研究發(fā)現(xiàn)miR-93、miR-106b和miR-25等通過調(diào)控細(xì)胞周期而影響細(xì)胞生長(zhǎng)[14]，這與本研究在骨肉瘤中的研究結(jié)果類似。

綜上所述，miR-93在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，很可能成為一個(gè)新的骨肉瘤形成前的標(biāo)志物，為骨肉瘤基因治療提供新的靶點(diǎn)。

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