趙 新

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 內(nèi)科，新疆 烏魯木齊 830011）

茶是一種由山茶科植物葉片制成的飲料[1]。其中，綠茶在亞洲地區(qū)尤其是我國深受人們青睞。近年來，國內(nèi)外眾多研究者對(duì)綠茶中的提取物進(jìn)行了大量的研究，其中的細(xì)胞培養(yǎng)等研究提示綠茶對(duì)人體大多數(shù)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有抑制作用[2]。綠茶干重的30%～42%是兒茶素（catechins）包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG），表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC），表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin gallate，ECG），表兒茶素（Epicatechin，EC）[3]。其中，表沒食子兒茶素沒食子酸酯的抗癌作用尤為顯著。一系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明EGCG對(duì)多種腫瘤均存在抑制作用[4]。EGCG可能通過干擾癌細(xì)胞生存所需的信號(hào)傳導(dǎo)而發(fā)揮其抗腫瘤作用[5-6]。該實(shí)驗(yàn)旨在通過MTT法檢測(cè)EGCG對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響，同時(shí)通過免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)及Western blot法觀察EGCG作用后HepG2細(xì)胞中Cyclin D1、Bcl-2的表達(dá)，探討EGCG發(fā)揮抗腫瘤作用的可能機(jī)制是否與其在體外引起細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡，但卻不引起明顯的細(xì)胞毒性有關(guān)，從而為肝癌化療新藥的開發(fā)提供可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HepG2購于武漢細(xì)胞庫。RPMI 1640購自Gibco BRL。FBS購自杭州四季青公司。EGCG購于ALEXIS BIOCHEMICALS（純度＞95%，高效液相色譜法），DMS0 購自 Sigma。MTT，鼠抗人 Cyclin D1，Bcl-2，Beta-actin單抗，SP 試劑盒，96孔板，6孔板購自武漢薈萃生物公司。

1.2 儀器與設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱（2406-2），美國SHELLAB公司；倒置相差顯微鏡（DM3000），德國Leica公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（ELX800），奧地利DIALAB公司；凝膠分析儀（GelDoc2000），美國BIO-RAD公司。

1.3 主要方法

HepG2常規(guī)培養(yǎng)、增殖、傳代、擴(kuò)增以備用。細(xì)胞呈上皮樣貼壁生長，當(dāng)生長至70%～80%融合時(shí)胰酶消化傳代，以培養(yǎng)液吹打制成細(xì)胞懸液，按不同實(shí)驗(yàn)所需濃度接種。

1.3.1 MTT法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長期的HepG2按每孔1×105個(gè)接種于96孔板，每孔終體積為100μL。待12 h細(xì)胞完全貼壁后加入不同濃度（1、5、25 和 125mg/L）并設(shè)不接種細(xì)胞的空白對(duì)照。每一濃度做6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入MTT 20μL，37℃孵育4 h 3000 r/min離心10 min后小心吸棄上清。每孔加入DMSO 150μL輕輕震蕩10min，在490 nm波長酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔OD值，求平均值。細(xì)胞抑制率=（對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組）/對(duì)照組×100%。

1.3.2 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)Cyclin D1，Bcl-2的表達(dá)對(duì)數(shù)生長期HepG2消化制成細(xì)胞懸液后，調(diào)密度為5×104個(gè)/mL，每孔1mL細(xì)胞懸液接種于事先放置好蓋玻片的6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后分別加入5、25mg/L的EGCG，設(shè)不加藥的對(duì)照組。培養(yǎng)24 h后取出玻片，PBS洗后4%多聚甲醛固定10min，正常羊血清室溫封閉30min，滴加一抗（1∶50）4℃冰箱中過夜，滴加生物素化二抗室溫孵育30min，滴加SP復(fù)合物室溫孵育30min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片，觀察照像。

1.3.3 W estern blot法檢測(cè) Cyclin D1，Bcl-2 的表達(dá) 收集藥物作用后的HepG2各組細(xì)胞，提取總蛋白，用超微量紫外分光光度儀定量蛋白。取40μg總蛋白進(jìn)行電泳后，蛋白轉(zhuǎn)移至0.22μm PVDF膜。然后一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1.5 h。ECL化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光，X線膠片進(jìn)行顯影、定影、圖像分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 EGCG對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

不同濃度的EGCG作用HepG2細(xì)胞48 h后，MTT法測(cè)定吸光度（OD）值，結(jié)果顯示細(xì)胞生長受到不同程度的抑制，這種抑制作用呈濃度依賴性，隨著濃度的增大，OD值明顯減少，增殖抑制率明顯升高且與對(duì)照組相比差異有顯著性（P＜0.05）。見附表。

附表 EGCG對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響 （n=6，）

附表 EGCG對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響 （n=6，）

注：?與對(duì)照組相比，差異有顯著性，P＜0.05

組別 OD 抑制率/%對(duì)照組 0 1.187±0.05藥物EGCG 10.749±0.03? 7.750.602±0.02? 9.625 0.458±0.02? 47.7125 0.147±0.03? 80.8

2.2 免疫組化SP方法測(cè)定Cyclin D1和Bcl-2的表達(dá)

分別用5和25mg/L的EGCG處理HepG2細(xì)胞24 h后，免疫細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞染色強(qiáng)，Cyclin D1位于胞核，Bcl-2位于胞漿，染色后可見均勻的棕黃色顆粒；而處理組細(xì)胞Cyclin D1（圖1），Bcl-2（圖2）的表達(dá)水平與對(duì)照組的比較則有明顯下降。

2.3 Western blot法檢測(cè)Cyclin D1，Bcl-2的表達(dá)

EGCG處理HepG2細(xì)胞24 h后，提取蛋白，用Western Blot法檢測(cè)Cyclin D1和Bcl-2的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，EGCG處理組Cyclin D1和Bcl-2的表達(dá)明顯降低（圖3）。

圖1 不同實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞中Cyclin D1的表達(dá)（×400）

圖2 不同實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)（×400）

圖3 Cyclin D1及Bcl-2表達(dá)的變化

3 討論

肝細(xì)胞癌是世界五大惡性腫瘤之一，具有高死亡率、早期癥狀隱匿、預(yù)后差等特點(diǎn)[7]。其分子發(fā)病機(jī)制以及臨床治療的特異性靶點(diǎn)已成為當(dāng)前人們普遍關(guān)注和迫切需要解決的問題。對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制的深入研究顯示，細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡平衡的破壞可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。研究細(xì)胞周期蛋白以及凋亡抑制蛋白在肝癌組織中的表達(dá)情況對(duì)研究肝癌的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義，對(duì)肝癌的治療有潛在的價(jià)值。

近年來，關(guān)于EGCG的抗瘤作用，已經(jīng)成為人們研究的熱點(diǎn)。YU等[8]研究發(fā)現(xiàn)含有兒茶素成分的非成熟李子提取物可以明顯誘導(dǎo)HepG2凋亡。該研究證實(shí)在體外EGCG可以通過抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。MTT比色法顯示EGCG呈濃度依賴性抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖。為了進(jìn)一步探討EGCG抗腫瘤的作用機(jī)制，通過免疫細(xì)胞化學(xué)以及Western blot法分析EGCG對(duì)Cyclin D1，Bcl-2表達(dá)的影響，用EGCG處理肝癌HepG2細(xì)胞后，各處理組分別出現(xiàn)Cyclin D1、Bcl-2的表達(dá)下調(diào)。細(xì)胞周期調(diào)控異常導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖是腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)。在細(xì)胞周期的進(jìn)程中，關(guān)系到整個(gè)細(xì)胞周期啟動(dòng)的G1→S轉(zhuǎn)換即真核細(xì)胞中的檢查點(diǎn)，是保證基因組復(fù)制和分離忠實(shí)性的重要調(diào)控點(diǎn)。細(xì)胞是否能無限增殖，在一定程度上是基于其是否能順利通過檢查點(diǎn)。細(xì)胞周期蛋白D家族（Cyclin D）是一種重要的G1/S期正性調(diào)控分子，包括3個(gè)亞型：Cyclin D1、Cyclin D2與Cyclin D3，能促進(jìn)細(xì)胞增殖，加快細(xì)胞周期進(jìn)程，當(dāng)Cyclin D由于基因結(jié)構(gòu)或功能異常而表達(dá)失調(diào)，G1期縮短，細(xì)胞周期加快，使發(fā)生突變的基因組DNA得不到修復(fù)、細(xì)胞亦不發(fā)生凋亡，則有可能導(dǎo)致細(xì)胞無限增殖而誘發(fā)腫瘤。Cyclin D1是細(xì)胞周期啟動(dòng)因子，作用于G1/S期轉(zhuǎn)換過程，促使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。Cyclin D1的超表達(dá)可使細(xì)胞發(fā)生難于控制的持續(xù)性增殖。近年來，有不少研究表明Cyclin D1基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并被認(rèn)為是一種原癌基因[9-10]。Cyclin D1過表達(dá)可見于乳腺癌、食管癌、胃癌、肺癌、頭頸部腫瘤、子宮癌、膀胱癌等多種腫瘤組織中。

EGCG可能通過下調(diào)Cyclin D1的表達(dá)，即檢查點(diǎn)重要正性調(diào)控分子Cyclin D1減少，從而使細(xì)胞無法從G1期順利的進(jìn)入到S期，細(xì)胞周期的進(jìn)程受到阻止。

正常細(xì)胞的增殖和凋亡是受到極其精細(xì)調(diào)控的基本生命現(xiàn)象。然而，惡性腫瘤細(xì)胞卻具有以下基本特征：一是細(xì)胞增殖失控，二是細(xì)胞凋亡紊亂。細(xì)胞凋亡（Apoptosis）是由于細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境變化或死亡信號(hào)觸發(fā)以及在基因調(diào)控下所引起細(xì)胞主動(dòng)死亡的過程，這一過程對(duì)于消除機(jī)體內(nèi)老化細(xì)胞或具有潛在性異常生長的細(xì)胞，以至于保持機(jī)體處于穩(wěn)定狀態(tài)起著至關(guān)重要的作用。體內(nèi)細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制發(fā)生紊亂將引起人體發(fā)生多種腫瘤的形成。細(xì)胞凋亡主要通過兩種途徑進(jìn)行：一種是通過激活細(xì)胞表面的凋亡受體，進(jìn)一步活化Caspase8，最終激活Caspase3而引起凋亡；另一種途徑則是各種刺激因子作用于線粒體時(shí)，線粒體膜釋放細(xì)胞色素C并激活Caspase9從而引起凋亡。bcl-2是細(xì)胞凋亡研究中最受重視的癌基因之一。Bcl-2能促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-2是阻斷細(xì)胞凋亡最后共同通路的關(guān)鍵蛋白，在其表面的疏水性溝能與促凋亡BH3域結(jié)合，該二聚體對(duì)凋亡的調(diào)節(jié)至關(guān)重要[11]。Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡亦可通過抑制細(xì)胞色素C的釋放和抑制Caspase的活化而實(shí)現(xiàn)[12-13]。

EGCG可能通過多種機(jī)制誘導(dǎo)凋亡，HAYAKAWA等[14]研究表明EGCG能與Fas結(jié)合，啟動(dòng)Fas介導(dǎo)的凋亡過程，活化Caspase8，從而誘導(dǎo)人單核細(xì)胞白血病U937凋亡。吳育晶等[15]發(fā)現(xiàn)EGCG誘導(dǎo)凋亡機(jī)制可能與其下調(diào)HepG2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)Caspase3活化有關(guān)。LEONE等[11]研究發(fā)現(xiàn)EGCG因具有獨(dú)特的gallate基團(tuán)而能與Bcl-2、Bcl-xL的疏水域緊密結(jié)合，故可直接有效抑制抗凋亡Bcl-2家族成員，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

EGCG還可能一方面通過下調(diào)抗凋亡基因bcl-2的表達(dá)，使凋亡基因的表達(dá)相對(duì)而言占優(yōu)勢(shì)，最終發(fā)揮其抗癌作用；另一方面如同白藜蘆醇誘導(dǎo)凋亡與細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)破壞相關(guān)[16]，EGCG對(duì)凋亡的誘導(dǎo)亦可能與其阻止細(xì)胞周期進(jìn)程，破壞細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)有關(guān)，故EGCG誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是否存在途徑選擇性，目前仍有待進(jìn)一步的研究。

該實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的EGCG對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGCG不僅抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，同時(shí)還明顯下調(diào)肝癌HepG2細(xì)胞中Cyclin D1和Bcl-2的表達(dá)。因此，可以推測(cè)EGCG可能通過對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)而發(fā)揮其抗腫瘤的作用。

目前，關(guān)于EGCG如何影響細(xì)胞增殖的機(jī)制仍不十分清楚。HASTAK等[17]通過對(duì)前列腺癌LNCaP細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)EGCG通過使p53蛋白的穩(wěn)定性增強(qiáng)并且上調(diào)p53表達(dá)，從而使其下游蛋白p21WAF1和Bax活性增強(qiáng)，使Bax/Bcl-2朝有利于腫瘤細(xì)胞凋亡的比例改變，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮其抗瘤作用。GUPTA等[18]認(rèn)為EGCG的抗癌作用主要在于干擾細(xì)胞周期的進(jìn)程導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞周期阻滯，與此同時(shí)朱寶和等[19]指出EGCG可以抑制VEGF誘導(dǎo)的血管生成，從而抑制腫瘤生長和血管生成。

綜上所述，近幾年EGCG已成為抗癌藥物研發(fā)的又一熱點(diǎn)，該實(shí)驗(yàn)初步探討了EGCG可能的抗癌機(jī)制，然而關(guān)于EGCG抗癌的確切機(jī)制仍有待更多實(shí)驗(yàn)室依據(jù)的證明和進(jìn)一步的闡明。

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