徐仟，孫振榮，李桂林，孫異臨，楊少華,，袁芳

顳葉內側癲癇(mesial temporal lobe epilepsy,MTLE)是頑固性癲癇中最常見的類型，發(fā)作起源于顳葉內側結構，主要病理改變是海馬硬化，表現(xiàn)為星形膠質細胞大量增生和神經(jīng)元顯著丟失；切除硬化海馬是臨床控制癲癇發(fā)作的有效方法。MTLE特殊的病理變化促進人們開始關注星形膠質細胞在癲癇發(fā)病中的作用。

星形膠質細胞是大腦中數(shù)量最多的神經(jīng)細胞，在維持腦內微環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用。已有的研究表明，神經(jīng)元的興奮性與細胞外間隙及K+濃度變化密切相關。近年來的研究已證實，水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)和內向整流性鉀離子通道(inwardly rectifying potassium channel,Kir4.1)在星形膠質細胞血管周圍足突(perivascular astrocyte end-feet,pAST-ef)上呈現(xiàn)極性分布，兩者不僅在結構上共表達[1-2]，而且在功能上相耦聯(lián)[3-4]：AQP4介導水分子跨細胞膜轉運的同時，伴隨著Kir4.1對細胞外K+緩沖作用，共同維持腦組織內環(huán)境的穩(wěn)定[5]。Amiry-Moghaddam等發(fā)現(xiàn)，敲除α-syntrophin基因的小鼠驚厥易感性增加，同時海馬區(qū)域pAST-ef存在AQP4顯著缺失和Kir4.1部分缺失，細胞外K+清除時間延長，提示AQP4和Kir4.1極性分布改變可能參與癲癇的發(fā)生[6]。本實驗擬應用手術切除MTLE海馬組織，運用免疫熒光染色技術觀察星形膠質細胞AQP4和Kir4.1的分布情況，為探討星形膠質細胞在顳葉內側癲癇發(fā)生中的作用提供形態(tài)學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑和實驗器材 膠質纖維酸性蛋白抗體(glial fibrillary acidic protein,GFAP)： DAKO,Z0334；AQP4抗體：ABCAM,ab46182；Kir4.1抗體：ABCAM,ab80959；山羊抗兔熒光二抗：中杉金橋，IgG/Dylight594，紅色；山羊抗兔熒光二抗：中杉金橋，F(xiàn)ITC，綠色；DIPA封片劑：中杉金橋，ZLI-9057；光學顯微鏡：OLYMPUS,SZX-MVX10；透射電子顯微鏡：HITACHI,H-7650；倒置相差熒光顯微鏡：NIKON，Eclipse E600)。

1.2 實驗材料 收集2009年9月~2011年4月首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科16例行海馬切除術治療癲癇患者的海馬組織。切除海馬組織離體后，即刻放入4%多聚甲醛及2.5%戊二醛中固定，分別進行后續(xù)處理。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組 海馬組織經(jīng)常規(guī)固定、包埋、切片(片厚4μm)及HE染色后，在光學顯微鏡下觀察。依據(jù)病理學改變將海馬組織分為病例組(MTLE)和對照組(非顳葉內側癲癇，non-mesial temporal lobe epilepsy,non-MTLE)。MTLE海馬硬化診斷標準為海馬組織神經(jīng)元丟失>50%及大量星形膠質細胞增生[7]，共10例；non-MTLE診斷標準為海馬組織表現(xiàn)為輕度神經(jīng)元丟失(<25%)及少量星形膠質細胞增生，存在海馬結構附近腦組織的病變[7]，共6例，分別為節(jié)細胞膠質瘤1例、皮層發(fā)育不良4例、靜脈瘤1例。詳見表1。

1.3.2 透射電鏡檢查 海馬組織2.5%戊二醛4℃固定2 h后，依次1%鋨酸固定，環(huán)氧丙烷置換，樹脂(EPON 812)包埋，1μm半薄切片定位，40 nm超薄切片醋酸雙氧鈾-枸櫞酸鉛染色，在透射電鏡(H-7650)下觀察。對照組選擇4例，病例組選擇7例。

1.3.3 免疫熒光組織化學染色及圖像分析 制備4μm石蠟切片，0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH=6.0)微波熱修復，山羊血清封閉，分別滴加一抗GFAP(1∶400)、AQP4(1∶80)、Kir4.1(1∶20)，4 ℃孵育過夜；IgG/Dylight594或FITC標記熒光二抗(山羊抗兔1∶100)室溫孵育2 h；DIPA封片劑封片，倒置相差熒光顯微鏡觀察、拍照。陰性對照用PBS代替一抗，其余步驟相同。應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，將圖片黑白反相處理，隨機選取6個pAST-ef區(qū)域及6個等面積其他部位區(qū)域計算平均光密度值(average optical density,AOD)，分別記為AOD1和AOD2，以AOD1/AOD2值表示pAST-ef部位AQP4或Kir4.1的蛋白表達水平。

表1 患者基本資料

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0 for Windows統(tǒng)計軟件進行t檢驗，顯著性水平α=0.05。應用Microcal Origin統(tǒng)計繪圖軟件做圖。

2 結果

2.1 光鏡檢查 HE染色顯示對照組海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)正常，星形膠質細胞輕度增生(圖1)；GFAP免疫熒光染色顯示陽性細胞著色淺淡，血管周圍綠色熒光提示星形膠質細胞足突包繞血管(圖2)。病例組海馬CA3區(qū)神經(jīng)元顯著丟失，星形膠質細胞大量增生(圖1)，GFAP陽性細胞著色加深，血管周圍綠色熒光著色較細胞其他部位淺淡，同時與血管壁之間間隙增大(圖2)。陰性對照未見GFAP著色。

2.2 透射電鏡檢查 對照組海馬組織星形膠質細胞胞體輕度腫脹；神經(jīng)元核膜輕度凹陷，線粒體輕度腫脹；血管形態(tài)正常(圖3)。病例組海馬組織星形膠質細胞胞體及血管周圍足突均高度腫脹；神經(jīng)元核膜皺縮，核內染色質聚集，線粒體高度腫脹；血管受壓，管腔狹長，內皮細胞不同程度增生(圖3)。

2.3 免疫熒光組織化學染色 對照組中AQP4主要分布于pAST-ef，其他部位沒有分布；病例組中AQP4在pAST-ef分布減少，而其他部位分布明顯增加(圖4)。Kir4.1的分布及變化與AQP4相似(圖4)。陰性對照均未見AQP4及Kir4.1著色。圖像分析顯示，pAST-ef部位AQP4蛋白表達量在對照組及病例組分別為(27.69±5.42)及(2.93±0.48)(P<0.05)；Kir4.1蛋白表達量分別為(39.33±5.18)及(13.77±2.72)(P<0.05)。

3 討論

人MTLE特殊的病理改變?yōu)檠芯啃切文z質細胞在癲癇發(fā)病中的作用提供了一個很好的模型。本研究發(fā)現(xiàn)，MTLE患者硬化海馬區(qū)域星形膠質細胞大量增生伴高度腫脹，星形膠質細胞上AQP4和Kir4.1發(fā)生再分布，提示兩者極性分布的改變參與了MTLE的病理過程。

AQP4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布最廣泛的水通道蛋白，特異地在星形膠質細胞膜上表達，起著跨膜轉運水分子的作用[8]。生理狀態(tài)下，AQP4在星形膠質細胞膜上呈極性分布，主要分布在pAST-ef，細胞外間隙水分子通過星形膠質細胞轉運到血管，以維持細胞內外水分代謝平衡[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，MTLE患者硬化海馬區(qū)域星形膠質細胞腫脹，AQP4極性分布發(fā)生改變，在pAST-ef顯著減少，而其他部位分布增加，說明AQP4功能障礙導致星形膠質細胞腫脹。Eid等也報道，與non-MTLE相比，MTLE患者硬化海馬pAST-ef處AQP4分布減少44%左右[11]。我們推測，AQP4的再分布影響了星形膠質細胞對水平衡的調節(jié)作用，水分子滯留于星形膠質細胞內，導致細胞腫脹，細胞外間隙容積減少，間接引起細胞外興奮性氨基酸和K+濃度增加，提高局部腦組織的興奮性；另有研究顯示，腫脹的星形膠質細胞通過容積敏感性陰離子通道(volume-regulated anion channels,VRACs)釋放興奮性氨基酸，導致腦組織細胞外間隙興奮性氨基酸濃度增高，從而激活神經(jīng)元引起顳葉癲癇發(fā)生[12]。

Kir4.1亦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種重要的膜蛋白，主要在星形膠質細胞膜上表達，起著跨膜轉運K+的作用，且呈電壓依賴性[13]。星形膠質細胞靜息膜電位取決于K+擴散平衡電位，Kir4.1主要介導K+由細胞外向細胞內運輸；當神經(jīng)元興奮時細胞外K+濃度增加，細胞內外電壓差增高，K+通過星形膠質細胞上Kir4.1進入細胞內，再由pAST-ef處Kir4.1輸送到血管內，達到清除細胞外K+，維持內環(huán)境穩(wěn)定的作用[14]。雖然在星形膠質細胞瘤及膠質母細胞瘤上觀察到pAST-ef處Kir4.1極性分布改變[15]，但是在癲癇患者腦組織中Kir4.1分布變化還未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，MTLE患者硬化海馬區(qū)域Kir4.1在pAST-ef分布減少，極性分布改變，推測可能會引起星形膠質細胞清除K+能力降低。Hinterkeuser等利用膜片鉗技術發(fā)現(xiàn)，MTLE患者硬化海馬星形膠質細胞上Kir4.1對于細胞外K+緩沖能力降低，細胞外間隙K+聚集[16]。而細胞外K+濃度不足微摩爾水平的升高就可以急劇增加癲癇樣活動的發(fā)生[17-18]。另外，Kuncheryavykh等采用siRNA技術敲除大鼠大腦皮層膠質細胞的Kir4.1基因后發(fā)現(xiàn)，星形膠質細胞呈現(xiàn)去極化狀態(tài)，并且對細胞外谷氨酸攝取減少33%，使得細胞外谷氨酸濃度增加引起癲癇發(fā)生[19]。

根據(jù)以上研究結果推測，Kir4.1的再分布使K+由細胞運送到血管內產(chǎn)生障礙，K+在細胞內過量聚集及清除細胞外K+功能降低，細胞內外電壓差減低，呈現(xiàn)去極化狀態(tài)；Kir4.1對K+緩沖能力減弱，以及對谷氨酸攝取能力的減低，加之AQP4再分布引起的胞外容積減少，使得神經(jīng)元產(chǎn)生興奮性后釋放到胞外的K+及谷氨酸異常聚集，引起局部腦組織興奮性增加，參與MTLE的發(fā)生。

[1]Masaki H,Wakayama H,Hara H,et al.Immunocytochemical studies of aquaporin 4,Kir4.1,and α1-syntrophin in the astrocyte endfeet of mouse brain capillaries[J].Acta Histochem Cytochem,2010,43(4):99-105.

[2]Ruiz-Ederra J,Zhang H,Verkman AS.Evidence against functional interaction between aquaporin-4 water channels and kir4.1 potassium channels in retinal muller cells[J].J Biol Chem,2007,282(30):21866-21872.

[3]Dibaj P,Kaiser M,Hirrlinger J,et al.Kir4.1 channels regulate swelling of astroglial processes in experimental spinal cord edema[J].J Neurochem,2007,103(6):2620-2628.

[4]Liu XQ,Kobayashi H,Jin ZB,et al.Differential expression of Kir4.1 and aquaporin 4 in the retina from endotoxin-induced uveitis rat[J].Mol Vis,2007,13:309-317.

[5]Nagelhus EA,Mathiisen TM,Ottersen OP.Aquaporin4 in the central nervous system:Cellular and subcellular distribution and coexpression with Kir4.1[J].Neuroscience,2004,129(4):905-913.

[6]Amiry-Moghaddam M,Williamson A,Palomba M,et al.Delayed K+clearance associated with aquaporin-4 mislocalization:Phenotypic defects in brains ofα-syntrophin-null mice[J].Proc NatlAcad Sci USA,2003,100(23):13615-13620.

[7]de Lanerolle NC,Kim JH,Williamson A,et al.A retrospective analysis of hippocampal pathology in human temporal lobe epilepsy:evidence for distinctive patient subcategories[J].Epilepsia,2003,44(5):677-687.

[8]師忠芳,袁芳.腦內水通道蛋白4表達調節(jié)的研究進展[J].中國康復理論與實踐,2007,13(8):724-726.

[9]Yang B,Zador Z,Verkman AS.Glial cell aquaporin-4 overexpression in transgenic mice accelerates cytotoxic brain swelling[J].J Biol Chem,2008,283(22):15280-15286.

[10]Manley GT,Binder DK,Papadopoulos MC,et al.New insights into water transport and edema in the central nervous system from phenotype analysis of aquaporin-4 null mice[J].Neuroscience,2004,129(4):983-991.

[11]Eid T,Lee TS,Thomas MJ,et al.Loss of perivascular aquaporin 4 may underline deficient water and K+homeostasis in the human epileptogenic hippocampus[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(4):1193-1198.

[12]Benfenati V,Caprini M,Nicchia GP,et al.Carbenoxolone inhibits volume-regulated anion conductance in cultured rat cortical astroglia[J].Channels(Austin),2009,3(5):323-336.

[13]Neusch C,Weishaupt JH,Bahr M.Kir channels in the CNS:emerging new roles and implications for neurological diseases[J].Cell Tissue Res,2003,311(2):131-138.

[14]Hibino H,Inanobe A,Furutani K,et al.Inwardly rectifying potassium channels:their structure,function,and physiological roles[J].Physiol Rev,2010,90(1):291-366.

[15]Warth A,Mittelbronn M,Wolburg H,et al.Redistribution of aquaporin 4 and Kir4.1 differs in low-and high-grade human brain tumors[J].Acta Neuropathol,2005,10(4):418-426.

[16]Hinterkeuser S,Schroder W,Hager G,et al.Astrocytes in the hippocampus of patients with temporal lobe epilepsy display changes in potassium conductances[J].Eur J Neurosci,2000,12(6):2087-2096.

[17]Benfenati V,Nicchia GP,Svelto M,et al.Functional down-regulation of volume-regulated anion channels in AQP4 knockdown culture rat cortical astrocytes[J].J Neurochem,2007,100(1):87-104.

[18]Devin K,Steinhauser B,Steinhauser C.Role of astrocytes in epilepsy[M].//Parpura V,Haydon PG.Astrocytes in(Patho)Physiology of the Nervous System.Berlin:Springer,2009:649-671.

[19]Kucheryavykh YV,Kucheryavykh LY,Nichols CG,et al.Downregulation of Kir4.1 inward rectifying potassium channels subunits by RNAi impairs potassium transfer and glutamate uptake by cultured cortical astrocytes[J].Glia,2007,55(3):274-281.