張吉娟 羅曉光 馮 昱 禹紅梅 任 艷 何志義

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽110001)

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最具有代表性的免疫細(xì)胞。自1891年首次描述小膠質(zhì)細(xì)胞以來，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用越來越受到人們的重視。小膠質(zhì)細(xì)胞在帕金森病、阿爾茲海默病及腦部炎癥、缺血等多種神經(jīng)系統(tǒng)病變中發(fā)揮著損傷和修復(fù)的雙重作用[1-3]。最新研究顯示CD200-CD200R通路是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的重要機(jī)制[4]。CD200與CD200R結(jié)合觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)放大系統(tǒng)功能，控制并下調(diào)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的活化。CD200是一種跨膜表達(dá)的糖蛋白，表達(dá)范圍較廣，主要在神經(jīng)細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等[5]。其受體為CD200R，主要表達(dá)在單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和少量的T細(xì)胞上，具有與其配體CD200非常相似的結(jié)構(gòu)[6]。CD200與 CD200R結(jié)合觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)放大的系統(tǒng)功能，控制并下調(diào)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的活化[7]。

本實(shí)驗(yàn)以鼠小膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞(BV2)和鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)細(xì)胞株分別代替小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，考察小膠質(zhì)細(xì)胞(BV2)在不同損傷神經(jīng)環(huán)境下CD200R的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞(BV2)與損傷神經(jīng)細(xì)胞(PC12)共育后，小膠質(zhì)細(xì)胞CD200R表達(dá)增多，細(xì)胞狀態(tài)良好。小膠質(zhì)細(xì)胞與受損神經(jīng)元之間的直接接觸和二者之間的雙向交流對于小膠質(zhì)細(xì)胞的CD200R表達(dá)至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 PC12及BV2培養(yǎng)及傳代 PC12及BV2分別種于PC12培養(yǎng)基(5% 胎牛血清1640，均購自Hyclone公司，美國)及BV2培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清DMEM，Hyclone公司，美國)中，其中PC12呈半懸浮狀態(tài)生長，傳代7～8次后，轉(zhuǎn)為貼壁生長。BV2為貼壁細(xì)胞。至細(xì)胞生長良好時開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程及分組

1.2.1 實(shí)驗(yàn)過程 以終濃度為500 nmol/L RT損傷PC12細(xì)胞，12小時后換新鮮1640培養(yǎng)液，再過12小時后收取上清及PC12細(xì)胞;損傷PC12上清與新鮮1640培養(yǎng)液以1∶3的比例用來培養(yǎng)BV2細(xì)胞;每孔收集的PC12細(xì)胞分成3等份分別與BV2細(xì)胞共育。正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞培養(yǎng)12小時后收取細(xì)胞及上清液，以上述比例用于試驗(yàn)。

1.2.2 具體分組 A、BV2以普通1640孵育作對照;B、BV2以正常PC12上清孵育;C、BV2以受損PC12上清孵育;D、BV2與正常PC12細(xì)胞共育;E、BV2與受損PC12細(xì)胞共育。

以孔板培養(yǎng)皿和相應(yīng)尺寸的轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)建立兩種細(xì)胞的共育培養(yǎng)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)孔徑8 μm，能允許轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)內(nèi)外的大分子蛋白和液體交流，但不允許細(xì)胞通過。共育結(jié)束后移走轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)及其上細(xì)胞，對培養(yǎng)皿上的細(xì)胞進(jìn)行單獨(dú)檢測。每組檢測時重復(fù)3～5次。

1.3 MTT檢測 BV2細(xì)胞分別與正常的PC12細(xì)胞、RT預(yù)處理的PC12細(xì)胞共育培養(yǎng)及用正常和損傷的PC12上清孵育、正常1640培養(yǎng)作對照。培養(yǎng)24小時，重復(fù)3孔，每組至少重復(fù)3次。兩種細(xì)胞的共育培養(yǎng)用轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)(孔徑8 μm的transwell)間隔。移走PC12及轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)，檢測時每孔加入MTT(5 g/L)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，棄上清。每孔加入150 μl DMSO，震蕩10分鐘后，酶標(biāo)儀570 nm波長下自動測OD值。細(xì)胞存活率(%)=處理組細(xì)胞OD/對照組細(xì)胞OD×100%。

1.4 倒置熒光顯微鏡檢測 細(xì)胞分別與正常的PC12細(xì)胞、RT預(yù)處理的PC12細(xì)胞共育培養(yǎng)及用正常和損傷的PC12上清孵育、正常1640培養(yǎng)作對照。培養(yǎng)24小時，重復(fù)3孔，每組至少重復(fù)3次。兩種細(xì)胞的共育培養(yǎng)用轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)(孔徑8 μm的transwell)間隔。移走 PC12及轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)，去上清，PBS漂洗1次，4%多聚甲醛室溫固定15分鐘，PBS漂洗1次，抗CD200R一抗孵育4℃過夜，PBS漂洗3次，熒光二抗室溫孵育1～2小時，PBS漂洗3次，鏡下觀察BV2。

1.5 ELISA檢測CD200R蛋白表達(dá) BV2細(xì)胞分別與正常的PC12細(xì)胞、RT預(yù)處理的PC12細(xì)胞共育培養(yǎng)及用正常和損傷的PC12上清孵育、正常1640培養(yǎng)作對照。培養(yǎng)24小時，重復(fù)3孔，每組至少重復(fù)3次。兩種細(xì)胞的共育培養(yǎng)用轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)(孔徑8 μm的transwell)間隔。移走PC12及轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)，去上清，PBS輕洗1遍。4%多聚甲醛室溫固定15分鐘，PBS輕洗 1遍，PBS 1×(1%BSA、0.1%Triton)固定1 小時，加入 CD200R(1∶300)40 μl每孔，4℃過夜，PBS 洗3 次，加入 Hrp二抗(1∶2 500)，每孔40 μl，變色后加入 40 μl H2SO4，震蕩 10 分鐘后，酶標(biāo)儀450 nm波長下測OD值，測出的OD值因受細(xì)胞數(shù)量的影響，需要與細(xì)胞存活率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，即ELISA OD值/細(xì)胞存活率，然后再進(jìn)行分析比較。

2 結(jié)果

2.1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與正常對照組相比，正常神經(jīng)細(xì)胞上清孵育組及損傷神經(jīng)細(xì)胞上清孵育組OD值顯著降低(P＜0.05)，細(xì)胞存活率下降，正常神經(jīng)細(xì)胞共育組及損傷神經(jīng)細(xì)胞共育組與正常對照組相比，OD值略高，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，細(xì)胞存活率無顯著差異 (見表1，圖1)。

2.2 倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果 普通倒置顯微鏡下可見，正常BV2細(xì)胞單層生長，細(xì)胞體呈細(xì)長或橢圓，從胞體發(fā)出細(xì)長而有分支的突起，表面有許多小棘突，胞體飽滿，細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞間聯(lián)系緊密，相互交織成簇狀。D、E組與正常BV2細(xì)胞形態(tài)一致。B、C組細(xì)胞數(shù)量減少，貼壁細(xì)胞由原來細(xì)長或橢圓變小、變圓，細(xì)胞突觸變短、甚至消失，細(xì)胞之間連接消失，核固縮，胞漿腫脹，胞膜尚完整。

表1 不同損傷神經(jīng)環(huán)境下BV2細(xì)胞的存活率(%)Tab．1 The survival rate of BV2 cells under different injury nerve environments(%)

圖1 不同損傷神經(jīng)環(huán)境下BV2細(xì)胞的存活率(%)Fig．1 The survival rate of BV2 cells under different injury nerve environments(%)

圖2 不同損傷神經(jīng)環(huán)境下BV2細(xì)胞CD200R的表達(dá)情況Fig．2 The expression of CD200R on BV2 cells under different injury nerve environments

熒光鏡下見CD200R陽性細(xì)胞呈紅色熒光，A、D、E組熒光明顯，尤以E組突出。B、C組熒光較弱，C組熒光斷續(xù)，部分消失(如圖2)。

2.3 ELISA檢測CD200R蛋白表達(dá) 經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后，與正常對照組(A組)相比，損傷神經(jīng)細(xì)胞上清孵育組(C組)OD值顯著降低(P＜0.05)，細(xì)胞CD200R表達(dá)減少;損傷神經(jīng)細(xì)胞共育組(E組)OD值顯著升高(P＜0.05)，細(xì)胞CD200R表達(dá)增加。正常神經(jīng)細(xì)胞上清孵育組(B組)，正常神經(jīng)細(xì)胞共育組(D組)與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。如表2、圖3。

3 討論

神經(jīng)元不僅僅是受小膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)的對象，它也能夠調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的活化[8]。而神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用主要是通過CD200-CD200R信號通路完成的，它在調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的活化中起到了關(guān)鍵的作用[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論與正?；蚴軗p的PC12共育，BV2細(xì)胞存活率與對照組無明顯變化，而且與受損的PC12共育顯著提高了BV2細(xì)胞CD200R的表達(dá)。此外，我們也看到無論是正常還是受損的PC12上清都可以影響B(tài)V2細(xì)胞的存活率，并且受損的上清使BV2的CD200R表達(dá)減少。提示小膠質(zhì)細(xì)胞與受損神經(jīng)元的直接接觸和與神經(jīng)元之間蛋白遞質(zhì)的雙向交流對于小膠質(zhì)細(xì)胞存活、活化和發(fā)揮生物學(xué)功能有很重要的影響。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示[10]與損傷PC12直接共育的BV2顯著提高了骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)營養(yǎng)功能，表現(xiàn)為以該骨髓間充質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液溫育受損PC12后，PC12的凋亡同對照組相比顯著減少，而與健康PC12共育的BV2一定程度上也提高了骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)營養(yǎng)功能。提示神經(jīng)元的損傷是小膠質(zhì)細(xì)胞對骨髓間充質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營養(yǎng)功能施加良性影響的重要條件。聯(lián)系本實(shí)驗(yàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞可能是通過CD200R發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)功能。本實(shí)驗(yàn)支持了小膠質(zhì)細(xì)胞的活化受神經(jīng)元的影響，并且在神經(jīng)變性病的早期神經(jīng)元通過CD200/CD200R信號系統(tǒng)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的能力更強(qiáng)，損傷神經(jīng)元較遠(yuǎn)處的小膠質(zhì)細(xì)胞CD200R表達(dá)低，可能表明處于較強(qiáng)的激活狀態(tài)，而受損神經(jīng)細(xì)胞附近的小膠質(zhì)細(xì)胞則有可能受到有效調(diào)控，提高CD200R表達(dá)，炎癥得到有效控制。

表2 標(biāo)準(zhǔn)化后的各組OD值Tab．2 Groups OD after standardization

圖3 各組CD200R的表達(dá)Fig．3 The expression of CD200R

因此，以CD200-CD200R為靶點(diǎn)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞有望成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究領(lǐng)域的新方向。從這條途徑出發(fā)較現(xiàn)行其他途徑可能更有前途，因?yàn)橐訡D200-CD200R為靶點(diǎn)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞不僅考慮到小膠質(zhì)細(xì)胞激活對神經(jīng)元的毒性作用，也考慮到神經(jīng)元對小膠質(zhì)細(xì)胞的作用，較現(xiàn)行的其他研究更符合機(jī)體內(nèi)部的規(guī)律，以保證機(jī)體完成復(fù)雜精確的信息傳遞。對CD200-CD200R信號系統(tǒng)的深入研究，可能為探討神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制及治療提供新的線索。

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