顏 愛 李 波 李潤(rùn)成 喻 凱 余興龍 (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128)

多糖是指由10個(gè)以上單糖分子鏈接成的碳水化合物。天然活性多糖是一種良好的免疫增強(qiáng)劑，能夠顯著提高機(jī)體的特異性或非特異性免疫。香菇多糖分離于香菇子實(shí)體，黃芪多糖由黃芪根部提取，兩者都具有很好的免疫調(diào)節(jié)作用，在抗病毒、抗腫瘤等方面有廣泛的應(yīng)用[1-3]，它們?cè)县S富，價(jià)格便宜，本研究選用兩種多糖腹腔注射免疫抑制模型小鼠，通過(guò)檢測(cè)小白鼠多項(xiàng)免疫指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)兩種多糖的免疫活性，為臨床上更好的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種雌性小鼠，18～22克，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.1.2 主要試劑 香菇多糖(純度＞45%，陜西方晟生物科技有限公司，BZ-021)，黃芪多糖(純度＞90%，陜西方晟生物科技有限公司，BZ-017)，依據(jù)文獻(xiàn)[4]提供方法去除多糖中的蛋白，用蒸餾水配制成濃度為10 mg/ml備用;環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，10051521);小鼠淋巴瘤細(xì)胞(Yac-1細(xì)胞，上海中科院細(xì)胞庫(kù)，TCM28);MTT(Sigma公司，88417)，細(xì)菌脂多糖(LPS，Sigma 公司，L2630);伴刀豆素球蛋白(ConA，Sigma公司，C2010);IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ檢測(cè)試劑盒(R＆D公司，批號(hào)分別為 VAL602、VAL603、VAL605、VAL607)。

1.2 方法

1.2.1 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)及臟器指數(shù)

1.2.1.1 動(dòng)物分組及處理 80只小鼠隨機(jī)平均分成8組，香菇多糖和黃芪多糖分別設(shè)高、中、低劑量組，依次為 20、13、7 mg/kg[5]，另設(shè)正常對(duì)照組(簡(jiǎn)稱對(duì)照組)和免疫抑制模型對(duì)照組(簡(jiǎn)稱模型組)。除對(duì)照組用等體積生理鹽水處理外，其余各組按40 mg/kg環(huán)磷酰胺制備免疫抑制模型，每天腹腔注射1次，連續(xù)3天。第4天除模型組外分別腹腔注射多糖溶液(0.5 ml/只)，均連續(xù)5天，模型組等體積注射生理鹽水。

1.2.1.2 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH) 小鼠連續(xù)腹腔注射香菇和黃芪多糖5天后，以0.2%的綿羊紅細(xì)胞懸液致敏所有小鼠，致敏后第4天用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠右后足跖部的厚度，測(cè)量三次取均值，然后局部注射20 μl的20%綿羊紅細(xì)胞，24小時(shí)后同一部位測(cè)定足跖厚度，以兩次平均厚度差表示DTH的程度。

1.2.1.3 臟器指數(shù) DTH試驗(yàn)完成后，斷頸法處死小鼠，稱量體重，解剖摘取免疫器官脾臟和胸腺，去除筋膜和脂肪組織后稱重，根據(jù)公式計(jì)算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。免疫器官指數(shù)=免疫器官重(mg)/體重(g)。

1.2.2 淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子

1.2.2.1 動(dòng)物分組及處理 40只小鼠隨機(jī)分成4組，10只/組，分別是對(duì)照組、模型組、香菇多糖組和黃芪多糖組，各組處理同前，多糖劑量根據(jù)上述結(jié)果選用13 mg/kg，給予多糖后4天，眼球摘除取血法收集血液，分離血清凍存?zhèn)溆茫缓髷囝i處死小鼠制備脾細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/ml)。靶細(xì)胞為復(fù)蘇傳代后收集的對(duì)數(shù)期Yac-1細(xì)胞(細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/ml)。

1.2.2.2 NK細(xì)胞活性 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的樣本測(cè)定孔加入已制備好的脾細(xì)胞和靶細(xì)胞懸液100 μl，效靶比50∶1，靶細(xì)胞自然釋放孔加入靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100 μl，靶細(xì)胞最大釋放孔加入靶細(xì)胞和2.5%Triton各100 μl，上述各項(xiàng)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，處理好后于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)，將培養(yǎng)物分別轉(zhuǎn)入滅菌離心管，1 500 r/min離心5分鐘，取上清100 μl置96孔培養(yǎng)板，同時(shí)加入乳酸脫氫酶(LDH)基質(zhì)液100 μl，反應(yīng)3分鐘后每孔加入1 mol/L HCl 30 μl，于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定光密度值(OD)，計(jì)算 NK細(xì)胞活性。NK細(xì)胞活性(%)=

1.2.2.3 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 調(diào)整脾細(xì)胞濃度至2 ×106個(gè)/ml，加入 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100 μl/孔，參照文獻(xiàn)[6]操作。

1.2.2.4 IL-2、IL-4、IL-10和 IFN-γ 含量 按照R＆D公司的ELISA試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書檢測(cè)血清中IL-2、IL-4、IL-10 和 IFN-γ 的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)資料均應(yīng)用Excel進(jìn)行處理，采用t檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用±s表示，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，P＞0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)DTH的影響 香菇多糖和黃芪多糖對(duì)免疫抑制小鼠DTH影響結(jié)果見表1。環(huán)磷酰胺能顯著抑制正常小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(P＜0.05)。兩種多糖各劑量均能有效消除環(huán)磷酰胺的抑制作用(P＜0.05)，并呈量效關(guān)系。比較多糖組與對(duì)照組，香菇多糖各劑量組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而黃芪多糖的中、高劑量組小鼠DTH不僅恢復(fù)，甚至顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。黃芪多糖在劑量為20 mg/kg時(shí)的作用尤為明顯(P＜0.01)，兩種多糖之間的差異不顯著。

表1 不同劑量的兩種多糖對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度的影響Tab．1 The effect of various doses of polysaccharides on DTH in mice

表2 黃芪多糖和香菇多糖對(duì)小鼠脾及胸腺指數(shù)的影響Tab．2 The influence of astragalus and lentinan on the spleen and thymus index of mice

表3 香菇及黃芪多糖對(duì)NK細(xì)胞活性的影響Tab．3 The influence of astragalus and lentinan on the activity of NK cell

表4 小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果(OD值)Tab．4 The mice spleen lymphocyte proliferation(OD value)

表5 IL-2、IL-4、IL-10 及 IFN-γ的濃度(pg/ml)Tab．5 The concentration of IL-2，IL-4，IL-10 and IFN-γ(pg/ml)

2.2 對(duì)脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響 結(jié)果見表2。與對(duì)照組相比，模型組小鼠胸腺指數(shù)顯著降低(P＜0.05)，脾指數(shù)顯著升高(P＜0.05)。在脾指數(shù)方面，兩種多糖各劑量組都能使其極顯著增高(P＜0.01)。就胸腺指數(shù)而言，多糖組與模型組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，香菇多糖組胸腺指數(shù)有隨劑量的增大而升高的趨勢(shì)，黃芪多糖組卻呈相反趨勢(shì)。兩種多糖各個(gè)劑量組之間差異不顯著。

2.3 對(duì)NK細(xì)胞活性的影響 以乳酸脫氫酶釋放法測(cè)定小鼠NK細(xì)胞活性(結(jié)果見表3)，環(huán)磷酰胺能顯著抑制小鼠NK細(xì)胞活性(P＜0.05)。香菇多糖和黃芪多糖不僅能恢復(fù)抑制小鼠的NK細(xì)胞活性(P＜0.01)，而且都明顯高于對(duì)照組。兩種多糖比較，香菇多糖對(duì)NK細(xì)胞活性的恢復(fù)作用優(yōu)于黃芪多糖，差異有非常顯著性意義(P＜0.01)。

2.4 對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響 MTT法測(cè)定小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力(表4)，結(jié)果顯示，模型組和對(duì)照組間差異不顯著;當(dāng)用LPS刺激脾淋巴細(xì)胞時(shí)，兩種多糖都能顯著提高小鼠B淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力(P＜0.05);當(dāng)使用ConA刺激時(shí)，香菇多糖和黃芪多糖均極顯著提升T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力(P＜0.01);兩種多糖影響T細(xì)胞增殖的差異不顯著，但在B細(xì)胞轉(zhuǎn)化方面香菇多糖極顯著高于黃芪多糖(P＜0.01)。

2.5 對(duì)細(xì)胞因子水平的影響 用ELISA方法檢測(cè)血清中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的濃度水平，結(jié)果見表5。環(huán)磷酰胺對(duì)于所測(cè)血清細(xì)胞因子水平均有明顯的抑制效果(P＜0.05)，兩種多糖皆能拮抗環(huán)磷酰胺的抑制作用，香菇多糖對(duì)四個(gè)因子水平的促進(jìn)作用極顯著(P＜0.01)，但只有IFN-γ水平恢復(fù)至正常，黃芪多糖僅顯著提高IL-4和IL-10水平，對(duì)IL-2和IFN-γ僅有恢復(fù)趨勢(shì)。此外，香菇多糖對(duì)IL-2、IFN-γ和IL-4三種因子的促進(jìn)作用要顯著高于黃芪多糖(P＜0.05)，而對(duì)于IL-10兩者差異不顯著。

3 討論

脾臟和胸腺是機(jī)體重要的免疫臟器，脾指數(shù)和胸腺指數(shù)在一定程度上可以反映機(jī)體免疫功能。環(huán)磷酰胺能升高脾臟指數(shù)可能是環(huán)磷酰胺停用后，脾臟會(huì)迅速恢復(fù)并出現(xiàn)“反跳”現(xiàn)象[7，8];而降低胸腺指數(shù)，則可能是胸腺淋巴細(xì)胞較脾淋巴細(xì)胞更易于凋亡，不僅如此，胸腺淋巴細(xì)胞的凋亡可直接或間接地促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖[9]，而且在應(yīng)激或免疫抑制劑的作用下，胸腺比脾臟更易于萎縮[10]。有研究發(fā)現(xiàn)香菇和黃芪兩種多糖有拮抗抑制劑降低小鼠臟器指數(shù)的作用，本研究中與其存在差異，從隨黃芪多糖劑量的增加胸腺指數(shù)降低的趨勢(shì)看，不排除是對(duì)胸腺的毒副作用，事實(shí)上有研究表明延長(zhǎng)黃芪多糖的給藥時(shí)間可對(duì)胸腺產(chǎn)生輕度的抑制作用[11]。

致有絲分裂原ConA和LPS可分別使小鼠T、B淋巴細(xì)胞分裂增殖，常用于衡量淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答的功能。在本研究中，兩種多糖的應(yīng)用可促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，說(shuō)明它們能恢復(fù)環(huán)磷酰胺對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用。

NK細(xì)胞即參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答，也是固有免疫重要的效應(yīng)細(xì)胞。NK細(xì)胞通過(guò)分泌IFN-γ、TNF-α和GM-CSF等細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，其自身的殺瘤功能也可被IFN-α、IFN-γ和IL-2等細(xì)胞因子所強(qiáng)化。多糖能消除環(huán)磷酰胺對(duì)NK細(xì)胞活性的抑制作用，表明香菇多糖和黃芪多糖在提高NK細(xì)胞活性方面有積極作用。

Th1和Th2細(xì)胞是兩種重要的淋巴細(xì)胞亞群，它們比例的相對(duì)恒定對(duì)維持免疫功能的穩(wěn)定至關(guān)重要，檢測(cè) IL-2、IFN-γ 和 IL-4、IL-10可以分別反映Th1和Th2細(xì)胞的功能，而且這些細(xì)胞因子也具有廣泛的生物學(xué)活性。本研究中，Th1和Th2型細(xì)胞因子均受到環(huán)磷酰胺的顯著抑制，香菇多糖對(duì)Th1和Th2型細(xì)胞因子水平都顯著提高，有利于抑制小鼠免疫功能的恢復(fù)，而黃芪多糖則對(duì)Th2的促進(jìn)作用更為明顯，可能是來(lái)源的不同的多糖對(duì)免疫的影響不同。

本文通過(guò)檢測(cè)免疫抑制小鼠多項(xiàng)免疫指標(biāo)評(píng)估香菇和黃芪多糖對(duì)小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用，表明香菇和黃芪多糖在劑量為13 mg/kg時(shí)可以較理想地恢復(fù)免疫抑制小鼠的免疫能力，且香菇多糖的效果優(yōu)于黃芪多糖。

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