吳秀麗 顏游游 宋丹丹 付 堯 華 立 王麗穎 王 華

(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)系，長(zhǎng)春130021)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其中大約25%～30%的浸潤(rùn)性乳腺癌過(guò)量表達(dá)人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(Human epidermal growth factor receptor2，HER2)，與乳腺癌病人在短時(shí)間內(nèi)的復(fù)發(fā)和生存期的縮短有關(guān)[1，2]。而 HER2在正常組織中低表達(dá)，使HER2成為治療HER2陽(yáng)性乳腺癌理想的靶點(diǎn)，很多應(yīng)用HER2全長(zhǎng)或HER2表位構(gòu)建的腫瘤疫苗已經(jīng)應(yīng)用到臨床前及臨床研究[3，4]。本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)熱休克蛋白65(Heat shock protein 65，HSP65)具有交叉提呈抗原作用將外源性抗原通過(guò)MHCⅠ類途徑特異性地呈遞給CD8+T細(xì)胞的功能，構(gòu)建了包含HSP65與多個(gè)HER2 CTL表位的融合蛋白(HSP65-HER2)并初步在體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了其抗腫瘤活性[5]，但沒(méi)進(jìn)一步驗(yàn)證其在體內(nèi)的抗腫瘤活性。

CpG ODN作為腫瘤疫苗的佐劑可增強(qiáng)腫瘤抗原的免疫原性，誘導(dǎo)出強(qiáng)大的Th1和CTL型免疫反應(yīng)，增強(qiáng)腫瘤疫苗的抗腫瘤效果[6]。本研究以小鼠HER2陽(yáng)性黑色瘤為模型，選用本室自行設(shè)計(jì)的CpG684作為HSP65-HER2的佐劑，驗(yàn)證二者聯(lián)用在機(jī)體內(nèi)的抗腫瘤效果。

1 材料與方法

1.1 試劑 RPMI1640干粉培養(yǎng)基，新生牛血清，胰蛋白酶均購(gòu)于Gibco，CpG684由大連寶生物工程有限公司合成。HSP65-HER2蛋白由本科室構(gòu)建表達(dá)后，凍干保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株 C57BL/6雌性小鼠，6～8周齡，由吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，轉(zhuǎn)染pcDNA3-GFP-HER2質(zhì)粒的小鼠黑色瘤細(xì)胞株(HER2+B16)來(lái)自吉林大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室[7]。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 把C57BL/6雌性小鼠，隨機(jī)分成3組，每組10只，分別為PBS陰性對(duì)照組，CpG684對(duì)照組，HSP65-HER2聯(lián)用CpG684免疫組。免疫流程:小鼠左右腹股溝皮下注射100 μl/只，CpG684的用量為 10 μg/只，HSP65-HER2的用量為 1 μg/只，每隔1周注射1次，共3次。在免疫結(jié)束后第4天，將制備的HER2+B16腫瘤細(xì)胞懸(0.75×105/只)接種到小鼠腹腔，并檢測(cè)小鼠的生存期。

2 結(jié)果

2.1 HSP65-HER2蛋白鑒定 SDS-PAGE電泳鑒定HSP65-HER2蛋白樣品(見(jiàn)圖1)。

圖1 HSP65-HER2的SDS-PAGE分析Fig．1 Analysis of HSP65-HER2 by SDS-PAGE

圖2 小鼠生存期Fig．2 Survival of mice

2.2 小鼠的生存期 生存期結(jié)果表明免疫了HSP65-HER2和CpG684的小鼠生存期明顯延長(zhǎng)，接種腫瘤70天后仍有80%的小鼠存活，而CpG684對(duì)照組僅有10%小鼠存活(P＜0.01)，PBS對(duì)照組無(wú)小鼠存活(P＜0.01)。見(jiàn)圖2。

3 討論

由于腫瘤抗原是弱抗原，而熱休克蛋白具有交叉提呈外源性抗原通過(guò)MHCⅠ類途徑提呈給CD8分子，并具有一定非特異性刺激作用，很多實(shí)驗(yàn)室將熱休克蛋白和腫瘤抗原融合制備腫瘤疫苗[8]。大量實(shí)驗(yàn)研究表明熱休克蛋白和腫瘤抗原融合蛋白疫苗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中都取得了良好的抗腫瘤效果，但是在臨床實(shí)驗(yàn)中的治療效果不夠理想，至今還沒(méi)有一種熱休克蛋白相關(guān)性的腫瘤疫苗被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床實(shí)踐[9]。這可能是由于熱休克蛋白的免疫刺激作用還不足以打破腫瘤導(dǎo)致的免疫耐受。為了使HSP65-HER2發(fā)揮更好的抗腫瘤效果，我們聯(lián)用了CpG684作為疫苗佐劑。CpG684是我們實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)的CpG ODN，其作為狂犬疫苗佐劑時(shí)顯著提高了抗體的產(chǎn)生并使誘導(dǎo)更強(qiáng)的Th1反應(yīng)，而Th1類反應(yīng)可以發(fā)揮更好的抗腫瘤效果[10]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明免疫了HSP65-HER2和CpG684激發(fā)的免疫應(yīng)答對(duì)于HER2+B16腫瘤的攻擊起到有效的保護(hù)作用，荷瘤小鼠的生存期顯著延長(zhǎng)(P＜0.01)。這種保護(hù)性的免疫應(yīng)答可能是以細(xì)胞免疫應(yīng)答為主，這是由于該實(shí)驗(yàn)小鼠腫瘤模型中所用的HER2+B16細(xì)胞表達(dá)的HER2蛋白沒(méi)有跨膜區(qū)，細(xì)胞表面缺乏HER2的靶點(diǎn)。此外HSP65-HER2多選用HER2的CTL表位，所以該疫苗激發(fā)的免疫反應(yīng)主要是CTL為主。該研究表明HSP65-HER2聯(lián)用CpG684發(fā)揮了明顯的抗腫瘤效果，為進(jìn)一步研究治療HER2陽(yáng)性乳腺癌的策略提供新的研究思路。

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