王曉天 李向陽 秦蘇萍 李小翠 尤紅娟 湯仁仙

(徐州醫(yī)學院病原生物學與免疫學教研室，徐州221002)

大鼠抗腎小球基底膜(GBM)腎炎是利用異體抗大鼠GBM抗體誘導后產生的具有典型的人類新月體性腎炎病理變化的動物模型[1]。此腎炎模型病程的早、中期，腎小球內大量的T細胞、巨噬細胞浸潤，腎小球內皮細胞明顯增多;病程晚期，腎小球細胞明顯減少、纖維化、硬化，最終喪失正常腎功能[1-3]。研究發(fā)現，腎小球內細胞數減少與細胞凋亡密切相關[4]。

大量研究表明，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員p38MAPK在人類新月體性腎小球腎炎發(fā)病過程中起到了很重要的作用。目前，研究的熱點主要集中在參與炎癥反應方面，而對于其是否參與了腎小球細胞凋亡研究很少。p38MAPK調控細胞凋亡的機制非常復雜[5-9]，其中p38 MAPK可通過增強Fas/FasL表達促進細胞的凋亡[7]。為此，本實驗利用大鼠抗GBM腎炎模型，運用工具藥p38MAPK特異性阻斷劑SB203580處理該模型，通過觀察腎組織中 p-p38MAPK、p38MAPK、FasL、Fas、Caspase-3蛋白表達，腎小球細胞凋亡以及腎組織病理學變化的情況，探討p38MAPK介導的Fas/FasL通路在大鼠抗GBM腎炎發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，為臨床防治人類新月體性腎炎提供實驗理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 正常健康SD大鼠25只，體重180～220克，由徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑 兔抗大鼠GBM血清(本實驗室制備并保存);尿蛋白定量測試盒、血肌酐測試盒及血尿素氮測試盒(南京建成生物工程研究所);兔抗大鼠p-p38MAPK多克隆抗體(Santa Cruz公司);羊抗大鼠p38MAPK多克隆抗體(Santa Cruz公司);兔抗大鼠 Fas多克隆抗體(Santa Cruz公司);兔抗大鼠FasL多克隆抗體(Santa Cruz公司);兔抗大鼠active-Caspase-3多克隆抗體(Sigma公司)，SB203580(Promega公司);大鼠免疫組化檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司);TUNEL試劑盒(美國Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 復制大鼠抗GBM腎炎模型及動物分組[10]正常SD大鼠10只，實驗前在本實驗室飼養(yǎng)4天，以適應環(huán)境。在此期間單籠收集大鼠24小時尿，測24小時尿蛋白含量，采血收集血清測血肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)含量，所有大鼠的上述指標均無異常。大鼠隨機分為兩組，腎炎模型組和正常對照組各5只。腎炎模型組大鼠一次性尾靜脈注射兔抗大鼠GBM血清;正常對照組大鼠尾靜脈注射等量正常兔血清，劑量均為1 ml/100 g[10]。腎炎模型組于實驗前1周足墊皮內注射正常兔血清進行預免疫。分別于實驗的第2、7、14、21和28天，收集24小時尿液檢測24小時尿蛋白含量，心臟采血收集血清檢測血肌酐和血尿素氮含量，取腎皮質用于免疫印跡檢測。在整個實驗過程中腎炎模型組和正常對照組大鼠均未見死亡。

1.2.2 腹腔注射阻斷劑SB203580及動物分組 正常SD大鼠15只，實驗前在本實驗室飼養(yǎng)4天，以適應環(huán)境，并檢測24小時尿蛋白含量、血肌酐和血尿素氮含量均無異常。復制大鼠抗GBM腎炎模型。隨機將大鼠分為三組，每組5只，阻斷劑SB203580組于注射兔抗GBM血清后3小時腹腔注射阻斷劑SB203580，1 mg/1 kg，隔天注射一次(SB203580 先溶于DMSO配成10 mmol/L的溶液，注射時用無菌生理鹽水將其配制成DMSO體積分數為10%的溶液)[11，12];溶媒組大鼠注射等體積的 DMSO 及無菌生理鹽水混合物;腎炎模型組不做任何處理。分別于實驗第2、7、14天收集24小時尿液檢測24小時尿蛋白含量，心臟采血收集血清檢測血肌酐和血尿素氮含量。于第14天處死大鼠，取腎皮質，一部分用于HE染色觀察腎組織病理改變，一部分用于免疫印跡、免疫組化及TUNEL凋亡檢測。

1.2.3 生化指標檢測 分別于不同時間點，收集大鼠24小時尿和血清樣本，采用考馬斯亮藍法(CBB法)測24小時尿蛋白含量;采用苦味酸除蛋白法測血肌酐含量，二乙酰一肟法測血尿素氮含量。

1.2.4 腎組織病理學檢查 SD大鼠經2%戊巴比妥鈉麻醉后，取小塊腎皮質用多聚甲醛固定后，石蠟包埋，制成切片后行HE染色，光鏡觀察腎小球體積大小、腎小球內細胞數、新月體形成及腎小管內蛋白管型等情況。

1.2.5 TUNEL法檢測腎小球凋亡細胞 按照TUNEL試劑盒說明書進行腎組織切片常規(guī)脫蠟水化，蛋白酶K孵育，3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶，封閉滴加TUNEL反應液，37℃孵育60分鐘，以標記溶液代替TUNEL反應液作為陰性對照，熒光顯微鏡觀察結果。熒光顯微鏡下，點狀綠色熒光即為陽性細胞。

1.2.6 蛋白免疫印跡檢測 取腎皮質組織勻漿、離心，BCA法測定蛋白濃度，進行蛋白定量。SDSPAGE分離后，轉移至硝酸纖維素膜，封閉。加1∶1 000一抗4℃過夜，再加1∶1 000二抗室溫孵育，顯色。用ImageJ軟件分析，以待檢測指標與GAPDH灰度值的比值來表示其相對含量。

1.2.7 免疫組織化學檢測 SD大鼠經2%戊巴比妥鈉麻醉后，取小塊腎皮質用多聚甲醛固定后，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片，貼片。切片脫蠟，梯度酒精脫水，消除內源性辣根過氧化物酶活性。PBS洗后用血清封閉，一抗4℃過夜，PBS洗3遍，辣根過氧化物酶標記的二抗，37℃孵育30分鐘，PBS洗3遍，DAB顯色，鏡檢控制顯色時間。然后蘇木素復染、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片，光鏡下觀察。

2 結果

2.1 動物分組生化指標變化情況 復制大鼠抗GBM腎炎模型，將大鼠分為兩組:腎炎模型組和正常對照組。分別于實驗的第2、7、14、21和28天采集尿液和血液做生化指標檢測。結果可示(表1):腎炎模型組大鼠24小時尿蛋白量于第2天開始升高，14天達高峰，后逐漸下降，但仍高于正常對照組(P＜0.05);血肌酐和血尿素氮于第2天開始升高，并隨著病程進展持續(xù)上升，各時間點均明顯高于正常對照組(P＜0.05)，這些皆與我們以前的實驗結果相一致，表明大鼠抗GBM腎炎模型復制成功[1，4]。

繼之，應用p38MAPK阻斷劑SB203580處理大鼠腎炎模型，并將大鼠分為三組:腎炎模型組、溶媒組和SB203580組，分別于第2、7、14天做生化指標檢測。結果顯示(表2)，SB203580組第7、14天時24小時尿蛋白量明顯減少，血肌酐、血尿素氮水平顯著降低。腎炎模型組和溶媒組生化指標無明顯改變，與SB203580組比較差異有顯著性(P＜0.05)。

2.2 動物分組p-p38MAPK、p38MAPK、FasL、Fas、Caspase-3蛋白的表達情況 在成功復制動物模型的基礎上，分別于第2、7、14、21和28天，取腎皮質檢測 p-p38MAPK、p38MAPK、FasL、Fas、Caspase-3 在不同時間點的表達水平。免疫印跡結果(圖1)顯示:腎炎模型組大鼠腎組織p38MAPK磷酸化水平于第2天就明顯高于正常對照組，此后一直維持在較高水平，與正常對照組相比差異有顯著性(P＜0.05);而p38MAPK蛋白表達量各時間點與正常對照組相比無明顯變化。FasL、Fas蛋白表達量于第2天開始升高，第14天達到高峰，第21天有所下降，但仍高于正常對照組(P＜0.05)。Caspase-3是重要的凋亡效應因子，正常情況下，Caspase-3蛋白酶以無活性的前體形式定位在胞漿中，只有當細胞凋亡時才被切割激活為有活性的Caspase-3。因此，用抗active-Caspase-3抗體作免疫印跡分析，檢測胞漿中切割后Caspase-3的活性片段，由圖1可知，Caspase-3活性于第2天開始升高，第21天達到高峰，與正常對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)。

表1 腎炎模型組和正常對照組大鼠各時間點生化指標(±s，n=5)Tab．1 Biochemical indexes of nephritic group and normal control group in rats(±s，n=5)

表1 腎炎模型組和正常對照組大鼠各時間點生化指標(±s，n=5)Tab．1 Biochemical indexes of nephritic group and normal control group in rats(±s，n=5)

Note:1)P＜0.05 vs normal control group.

Time(day) Groups 24 h urinary protein(mg/24 h)Scr(μmol/L)BUN(mmol/L)2 Nephritic group 5.85±0.391) 68.98±2.041) 5.75±0.371)04±0.59 Normal control group 4.96±0.42 60.15±4.75 5.09±0.51 7 Nephritic group 8.27±1.371) 84.76±4.961) 6.41±0.441)Normal control group 5.15±0.97 61.58±5.36 5.18±0.49 14 Nephritic group 26.48±2.431) 99.89±6.031) 7.06±0.621)Normal control group 5.10±1.03 63.37±4.92 5.02±0.51 21 Nephritic group 29.52±2.811) 129.96±6.371) 8.76±0.531)Normal control group 5.37±1.18 64.52±5.75 5.21±0.48 28 Nephritic group 24.31±2.371) 152.37±5.411) 9.91±0.721)Normal control group 5.04±0.94 62.15±4.78 5.

表2 SB203580組、腎炎模型組及溶媒組大鼠各時間點生化指標(±s，n=5)Tab．2 Biochemical indexes of SB203580 group，Nephritic group and Solvent group in rats(±s，n=5)

表2 SB203580組、腎炎模型組及溶媒組大鼠各時間點生化指標(±s，n=5)Tab．2 Biochemical indexes of SB203580 group，Nephritic group and Solvent group in rats(±s，n=5)

Note:1)P＜0.05 vs Nephritic group，2)P＜0.05 vs Solvent group.

Time(day) Groups 24 h urinary protein(mg/24 h)Scr(μmol/L)BUN(mmol/L)2 SB203580 group 5.11±0.271)2) 59.89±2.641)2) 5.35±0.291)2)39 Nephritic group 5.55±0.28 69.77±3.40 5.84±0.33 Solvent group 5.35±0.28 68.85±2.85 5.43±0.40 7 SB203580 group 5.14±0.351)2) 59.75±2.751)2) 5.61±0.401)2)Nephritic group 8.84±0.11 82.64±3.14 6.30±0.20 Solvent group 8.13±0.37 85.81±3.43 6.32±0.46 14 SB203580 group 11.03±1.201)2) 65.41±3.651)2) 5.59±0.311)2)Nephritic group 27.76±0.63 99.82±3.35 6.9±0.12 Solvent group 25.21±0.26 98.13±3.58 6.84±0.

圖1 腎炎模型組和正常對照組各時間點腎組織p-p38MAPK、p38MAPK、FasL、Fas和Caspase-3蛋白表達Fig．1 The expression of p-p38MAPK，p38MAPK，FasL，Fas and Caspase-3 in nephritic group and normal control group

隨后，應用免疫印跡及免疫組織化學方法檢測了腎炎模型第14天時p38MAPK阻斷劑SB203580對以上蛋白表達的影響。結果可示，SB203580明顯抑制了腎炎模型第14天時腎組織中p38MAPK的磷酸化水平、FasL、Fas的表達以及Caspase-3的活性，而SB203580對腎組織中p38MAPK蛋白的表達無影響(見圖2～4)。

2.3 動物分組腎組織病理學反應 本實驗室以前的結果顯示腎炎模型組大鼠尾靜脈注射兔抗大鼠GBM血清后2天[4]，腎小球內細胞數稍有增多;14天腎小球內細胞數明顯增多，細胞型新月體形成，腎小管內可見大量蛋白管型，間質大量炎性細胞浸潤。可見，14天時是腎炎模型組大鼠病理學反應較為嚴重的時期，因此，本實驗選擇第14天觀察SB203580是否可減輕腎炎大鼠病理學反應。結果顯示(圖5):腎炎模型組及溶媒組大鼠腎小球內細胞數明顯增多，間質淋巴細胞浸潤，腎小管內可見大量蛋白管型;而SB203580組，炎癥細胞浸潤較腎炎模型組明顯減少，腎小管內未見蛋白管型。

圖2 SB203580組、腎炎模型組及溶媒組第14天腎組織 p-p38MAPK、p38MAPK、FasL、Fas和Caspase-3蛋白表達Fig．2 The expression of p-p38MAPK，p38MAPK，FasL，Fas and Caspase-3 in SB203580 group，Nephritic group and Solvent group on the 14th day

圖3 SB203580組、腎炎模型組及溶媒組大鼠第14天腎組織FasL表達情況(免疫組織化學，10×40)Fig．3 The FasL expression of SB203580 group，Nephritic group and Solvent group in rats on the 14th day(p-v two steps，10×40)

圖5 SB203580組、腎炎模型組及溶媒組大鼠第14天腎組織病理學觀察(HE，10×40)Fig．5 The pathological changes of SB203580 group，Nephritic group and Solvent group in rats on the 14 th day(HE，10×40)

圖6 SB203580組、腎炎模型組及溶媒組大鼠第14天細胞凋亡情況(TUNEL，10×20)Fig．6 The apoptosis of SB203580 group，Nephritic group and Solvent group in rats on the 14 th day(TUNEL，10×20)

2.4 動物分組腎組織細胞凋亡情況 我們以前的實驗結果顯示，腎炎模型組大鼠腎小球內凋亡細胞數第2天開始升高，于14天達高峰，21天有所減少，但仍維持較高水平[4]。因此，本實驗選擇14天觀察SB203580對腎炎大鼠腎小球內凋亡細胞數的影響。TUNEL結果(圖6)可示:腎炎模型組及溶媒組大鼠腎小球、腎小管和腎間質部位可見大量凋亡細胞，鏡下呈綠色熒光。SB203580組腎小球、腎小管和腎間質部位也可見凋亡細胞，但數量較模型組及溶媒組明顯減少。

3 討論

大鼠抗GBM腎炎模型是研究人類新月體性腎炎發(fā)病機制的常用動物模型，此模型病程的早、中期，腎小球內大量的免疫細胞浸潤，腎小球內皮細胞明顯增多;至病程晚期，腎小球內細胞明顯減少，腎小球纖維化，最終腎功能完全喪失。我們以前的實驗表明病程晚期腎小球細胞明顯減少與細胞凋亡密切相關，證實細胞凋亡參與了抗GBM腎炎的發(fā)病機制，加重了腎炎病變[4]。

研究發(fā)現，p38MAPK是誘導細胞凋亡的重要物質之一，炎癥細胞如巨噬細胞、中性粒細胞和T淋巴細胞的激活可誘導p38 MAPK的磷酸化，磷酸化的p38 MAPK轉位到細胞核，使轉錄因子(ATF-2、c-Jun、NF-κB)活化，從而調節(jié)多種基因的轉錄和表達，調控細胞的增殖、分化和凋亡[13]。而有關內容目前在人類新月體腎小球腎炎發(fā)病機制中少見報道。大量文獻顯示[5-9]，p38 MAPK經多條途徑調控細胞凋亡，其中p38 MAPK可通過增強Fas/FasL表達促進細胞的凋亡[7]。此外，我們以前的研究[4]發(fā)現，在大鼠抗GBM腎炎中，腎小球細胞凋亡、新月體形成及病程進展與Fas/FasL誘導的細胞凋亡密切相關。因此，大鼠抗GBM腎炎模型中，p38MAPK是否可以誘導腎小球細胞凋亡以及是否可經Fas∕FasL通路誘導，從而加重腎炎病變，是本實驗研究的重點。

為了證實以上觀點，我們首先成功復制了大鼠抗GBM腎炎模型，并分別于實驗的第2、7、14、21和28天取腎組織檢測 p-p38MAPK、p38MAPK、FasL、Fas、Caspase-3的表達水平。免疫印跡結果顯示:腎炎模型組p38MAPK磷酸化水平于第2天就明顯高于正常對照組，此后逐漸上升，一直維持在較高水平，而腎炎模型組p38MAPK蛋白表達量各時間點與正常對照組相比無明顯變化;FasL、Fas蛋白表達量于第2天開始升高，第14天達到高峰，第21天有所下降;Caspase-3活性于第2天開始升高，第21天達到高峰?？梢姡琾38MAPK磷酸化水平與FasL、Fas表達，Caspase-3激活趨勢基本一致。據此，我們推測:Fas/FasL通路的激活與p38MAPK的活化密切相關。

為了進一步證實這一點，我們選用了p38MAPK的特異性阻斷劑SB203580作為工具藥檢測其對大鼠抗GBM腎炎的作用。SB203580是吡啶咪唑芳基雜環(huán)類化合物，與p38MAPK競爭性結合ATP位點，使p38MAPK失去與ATP結合的能力，從而高效抑制p38MAPK的磷酸化，使其失去激酶活性，最終實現對p38MAPK通路的抑制。SB203580于注射兔抗GBM血清后3小時腹腔注射，此后隔天注射一次，于實驗第14天處死大鼠，采集標本進行相關研究。之所以選擇第14天作為此次研究的重點，是由于pp38MAPK、FasL、Fas的表達以及各項生化指標在第14天明顯增高，且腎小球細胞凋亡數于第14天達高峰[4]。

阻斷劑SB203580應用后，結果顯示:SB203580能夠明顯減少第7、14天時24小時尿蛋白，降低血肌酐、血尿素氮的水平;第14天時，SB203580抑制了大鼠腎炎模型中 p-p38MAPK、FasL、Fas、Caspase-3的表達;炎癥細胞浸潤明顯減少，腎小管內未見蛋白管型;腎小球、腎小管和腎間質部位凋亡細胞數量明顯減少。究其原因，可能是大鼠抗GBM腎炎模型建立后，炎癥細胞的激活誘導p38 MAPK磷酸化，磷酸化的p38MAPK轉位到細胞核，使轉錄因子ATF-2、c-Jun活化，從而促進Fas/FasL的表達增加[14];FasL與靶細胞表面的Fas結合，進而啟動Caspase級聯(lián)反應，導致腎組織中細胞大量凋亡，致使病程后期腎小球內細胞數進行性減少，最終加劇了腎小球纖維化，腎功能減退。

總之，通過本實驗研究，一方面證實了p38MAPK參與了大鼠抗GBM腎炎的發(fā)生發(fā)展如炎癥反應、細胞凋亡等，并能通過Fas/FasL信號通路誘導細胞凋亡;另一方面其阻斷劑SB203580能夠減輕大鼠抗GBM腎炎的病理反應，降低生化指標，這均為臨床進一步闡明人類新月體性腎小球腎炎的發(fā)病機制提供了實驗依據，且為防治人類新月體性腎炎提供了新的思路。

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