沈鶴 張力華 何學斌 郝棟 董玲玲

炎性衰老(inflamm aging)這一概念的核心就是機體的炎癥穩(wěn)態(tài)隨著增齡而逐漸出現(xiàn)失衡，機體的促炎性反應與抗炎性反應的平衡也出現(xiàn)失調[1-2]。

有相關研究發(fā)現(xiàn)，白介素-2(IL-2)及其受體在老年機體中的表達水平明顯下降[3-4]。夏世金等[2]研究發(fā)現(xiàn)在炎性衰老的進程中，TNF-α蛋白的表達明顯增加，說明促炎性細胞因子的蛋白正處于高表達狀態(tài)、機體也處于一種高促炎性反應狀態(tài)，機體的促炎性反應和抗炎性反應出現(xiàn)了平衡失調，從而加重了衰老發(fā)展的進程[5]。

多項研究表明，四君子湯具有多方面的生理活性，主要表現(xiàn)為可以調節(jié)機體各個器官的功能，增強免疫功能及抗氧化能力和應激能力，從而起到延緩衰老的作用[5]。

本研究旨在探討加味四君子湯對增齡大鼠免疫系統(tǒng)的調節(jié)作用和改善大鼠免疫系統(tǒng)增齡變化的可能作用機制，為進一步臨床應用防治或延緩衰老進程提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 動物 50只12月齡健康Wistar大鼠(湖北省醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，雌雄各半，體質量(370±50)g。10只3月齡健康Wistar健康大鼠，雌雄各半，體質量(170±10)g。各組大鼠在大致相同條件下，分籠飼養(yǎng)于華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院清潔動物實驗室，室溫(22±3)℃，相對濕度(65±5)%，通風良好，光照時間按照正常晝夜節(jié)律調節(jié)，標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水、攝食，無不良因素影響。

1.2 藥品制備與試劑 加味四君子湯由黨參、白術、茯苓、甘草、黃芪組成，中藥飲片購于武漢龍?zhí)┧帢I(yè)有限責任公司(產(chǎn)品批號:100101);經(jīng)水煮醇沉法制備成含生藥1 g/ml的藥液，然后分別加入蒸餾水配置成試驗所需的低、中、高不同濃度即0.25、0.5、1.0 g/ml的溶液，用無菌容器分瓶裝入高溫高壓消毒后，于4℃保存，每次使用前加熱至37℃。陽性對照組藥物為河南皖西制藥股份有限公司生產(chǎn)的六味地黃丸，將“六味地黃丸”丸劑研磨呈細粉狀，加入蒸餾水煎煮，配制成含藥0.24 g/ml的混懸液，每周制備1次備用，于4℃保存，每次使用前加熱至37℃。免疫球蛋白IgG檢測試劑盒購自寧波美康生物科技公司。檢測IL-2和TNF-α的免疫組化試劑一抗、二抗均購自北京奧博森生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及藥物處理:將50只12月齡大鼠隨機分為5組:藥物低劑量組、中劑量組、高劑量組、陽性對照組、老年對照組，每組各10只，雌雄各半;3月齡Wistar大鼠10只作為正常青年對照組，雌雄各半。每日由梨園醫(yī)院老研所動物房提供(購于湖北省醫(yī)科院)的普通大鼠顆粒飼料及自來水。各組大鼠分別給予相應藥物灌胃，依據(jù)實驗大鼠與人體的體重藥物比例系數(shù)換算，藥物低、中、高劑量組:每日灌服1.6、3.2、6.4 g/kg。陽性對照組:給予六味地黃丸混懸液1.5 g/kg。老年對照組:給予生理鹽水2 ml。每只大鼠分別于每日清晨進食前灌胃1次。每周稱重1次，依據(jù)大鼠體重調整給藥劑量，按照此法連續(xù)給藥90 d。灌胃期間，因灌胃操作技術等原因藥物低劑量組和老年對照組分別死亡2只和1只大鼠。

1.3.2 標本采集及處理:末次給藥24 h后，空腹稱量體重，于眼球后采血并用試管留置血樣，處理后放置－20℃冰箱中保存，用于檢測血清IgG的含量;摘除眼球后放血處死大鼠，于冰臺上迅速剪開胸、腹腔，游離并摘除胸腺、脾臟，電子天平稱量濕重，用于計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù);將胸腺和脾臟沿正中剖開，一部分置于20倍體積的4%多聚甲醛溶液中固定，以備用于常規(guī)石蠟包埋進行光鏡與免疫組化檢測。

1.3.3 觀察指標及檢測方法

1.3.3.1 血IgG測定:應用酶法在全自動生化分析儀上測定大鼠血清IgG含量。

1.3.3.2 胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的測定:

胸腺指數(shù)=胸腺濕重(mg)/大鼠體重(g)。脾臟指數(shù)=脾臟濕重(mg)/大鼠體重(g)。

1.3.3.3 胸腺、脾臟組織形態(tài)學觀察:將在多聚甲醛中固定后的胸腺、脾臟組織石蠟包埋，切片后以HE染色，光鏡下觀察組織的形態(tài)學改變。

1.3.3.4 胸腺IL-2、脾臟TNF-α表達檢測:采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶法，陰性對照以磷酸鹽緩沖液代替一抗。實驗步驟嚴格按照使用說明書進行。應用同濟醫(yī)學院全自動醫(yī)學彩色圖文報告分析系統(tǒng)進行圖像采集和結果數(shù)據(jù)分析。應用統(tǒng)計分析軟件求得平均光密度值(OD)及灰度值，進行免疫組化染色半定量分析。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料用均數(shù)±標準差(珋)表示;多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，用最小有意義差異法(LSD)進行兩兩比較，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清IgG含量的比較 與青年對照組比較，增齡各組大鼠IgG水平均明顯降低(P＜0.01);與老年對照組比較，陽性對照組和藥物組的中劑量組和高劑量組的IgG明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)。與陽性對照組比較，藥物組的IgG含量降低(P＜0.01)。見表1。

表1 各組免疫指標比較

表1 各組免疫指標比較

注:與青年組比較，＊＊P＜0.01;與老年對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與陽性對照組比較，##P＜0.01

組別 例數(shù)(n) IgG(g/L) 胸腺指數(shù) 脾臟指數(shù) IL-2(OD) TNF-α(OD)青年對照組 10 6.01±0.51 1.78±0.44 5.32±0.26 0.27±0.05 0.31±0.04老年對照組 9 4.23±0.63＊＊ 0.49±0.23＊＊ 3.59±0.87＊＊ 0.13±0.01＊＊ 0.32±0.05＊＊陽性對照組 10 5.35±0.59＊＊△△ 0.49±0.35＊＊ 3.61±0.70＊＊ 0.17±0.00＊＊△△ 0.28±0.03＊＊△△藥物低劑量組 8 4.23±0.52＊＊## 0.75±0.31＊＊△△##3.60±0.83＊＊ 0.14±0.00＊＊△△##0.28±0.08＊＊△△##藥物中劑量組 10 4.39±0.31＊＊△## 0.63±0.35＊＊△△##3.15±0.68＊＊△△##0.26±0.09＊＊△△##0.28±0.08＊＊△△##藥物高劑量組 10 5.13±0.40＊＊△△##0.80±0.14＊＊△△##3.82±0.77＊＊△△##0.20±0.09＊＊△△##0.29±0.04＊＊△△##

2.2 各組大鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的比較 與青年對照組比較，增齡各組大鼠胸腺指數(shù)均顯著降低(P＜0.01);與老年對照組相比較，陽性對照組的胸腺指數(shù)無顯著性差異，藥物組的胸腺指數(shù)升高(P＜0.01)，以高劑量組升高最為顯著;與陽性對照組相比，藥物組胸腺指數(shù)升高(P＜0.01)。見表1。

與青年對照組比較，增齡各組大鼠脾臟指數(shù)均顯著降低(P＜0.01);與老年對照組比較，陽性對照組和藥物低劑量組的脾臟指數(shù)無明顯差異(P＞0.05)，中劑量組的脾臟指數(shù)顯著降低(P＜0.01)，高劑量組的脾臟指數(shù)顯著升高(P＜0.01);與陽性對照組相比較，藥物組低劑量組脾臟指數(shù)變化無明顯差異(P＞0.05)，中劑量組的脾臟指數(shù)顯著降低(P＜0.01)，高劑量組的脾臟指數(shù)顯著升高(P＜0.01)。見表1。

2.3 胸腺組織形態(tài)學變化 增齡各組大鼠的胸腺組織與青年組相比明顯萎縮，大部分的胸腺組織被結締組織和脂肪組織所替代，胸腺的皮質、髓質明顯變薄，可見少量的淋巴細胞及大量的漿細胞和巨噬細胞，小葉內的胸腺細胞數(shù)量明顯減少，排列比較稀疏。與老年對照組比較，藥物組和陽性對照組胸腺上述病理改變均有不同程度的減輕，胸腺細胞分布較密，著色良好。

2.4 脾臟組織形態(tài)學變化 增齡各組大鼠脾臟組織的結構紊亂，白髓和紅髓的分界不清楚，白髓減少，巨噬細胞和中性粒細胞數(shù)量增多，淋巴細胞排列比較疏松，白髓中的纖維減少、紅髓中的纖維增多、變粗。與老年對照組相比較，藥物組和陽性對照組脾臟鏡下觀上述形態(tài)學改變有一定的改善，但白髓和紅髓的分界欠清晰，白髓略微增多。

2.5 胸腺IL-2表達 青年組大鼠可見IL-2陽性細胞在胸腺內分布不十分均勻，在髓質中的分布比較密集，大部分集中在皮質和髓質的交界處以及髓質處;陽性細胞的胞漿被染成棕色或棕褐色顆粒，陽性表達的強弱程度不等;細胞的胞體比較大，形態(tài)各異;在細胞之間可以見到大量的、散在分布的陽性分泌物。

與青年對照組比較，增齡各組的胸腺組織的IL-2染色強度顯著降低(P＜0.01);與老年對照組比較，陽性對照組和藥物組的IL-2表達強度顯著升高(P＜0.01)。中劑量組明顯高于低劑量組和高劑量組;另外，與陽性對照組比較，高劑量組和中劑量組的表達明顯升高，低劑量組的表達明顯降低。見表1。

2.6 脾臟TNF-α表達 TNF-α表達在脾臟組織細胞的細胞膜和細胞漿中，其陽性信號主要位于中性粒細胞、單核巨噬細胞內，呈均勻的黃色或棕褐色細顆粒狀。與青年對照組比較，老年對照組脾臟組織的TNF-α染色光密度顯著增強(P＜0.01)。與老年對照組比較，藥物組和陽性對照組表達量顯著降低(P＜0.01)。TNF-α在低、中、高劑量組脾臟組織均可見陽性表達，其中低劑量組，中劑量組和高劑量組的表達量大致相同，高劑量組的表達量最高。中劑量組脾臟組織陽性表達量與陽性對照組無顯著差異(P＞0.05)。見表1。

3 討論

免疫衰老即免疫系統(tǒng)隨著年齡的增長而發(fā)生的進行性退變，這種改變的逐漸積累則導致機體對感染和接種疫苗應答能力的降低[7]。隨著年齡的增加，免疫器官老化，吞噬細胞的吞噬功能降低，細胞遷徙特性改變、細胞類群和數(shù)量以及抗體產(chǎn)生的能力等也發(fā)生相應變化，從而增加感染、細胞惡變和自身免疫性疾病的機會[8]。胸腺和脾臟是機體的免疫器官，胸腺隨年齡的增長而逐漸萎縮，結果導致免疫功能下降。脾臟有合成和分泌免疫物質的功能，老年人的脾臟萎縮，同樣導致免疫功能下降，免疫功能下降是造成機體衰老的原因之一[8]。

四君子湯為延緩衰老的代表方劑，作用緩和，療效確切。四君子湯(人參、白術、茯苓、甘草)的近期研究結果證明，該方能夠降低脂質過氧化物的含量和升高血清超氧化物酶的活力，具有抗自由基損傷的功能;可明顯改善衰老小鼠的肝細胞超微結構，使其恢復正常狀態(tài);顯著延長脾虛小鼠生命活力，增加其胸腺質量，提高免疫功能，降低實驗動物血清中LEP和肝中脂褐素含量[5]。

本研究證實了加味四君子湯多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點的整體調節(jié)機制。具有顯著的延緩衰老的作用，其作用的發(fā)揮是通過多層次而實現(xiàn)的，其中包括調節(jié)免疫球蛋白、提高中央和外周免疫器官的功能、和改善因衰老所致的細胞形態(tài)學異常改變等方面。其發(fā)揮延緩衰老的作用往往以中、高劑量表現(xiàn)得更為全面和穩(wěn)定，提示其在一定范圍內呈量效關系。加味四君子湯具有提高老齡大鼠胸腺組織IL-2的水平，上調脾臟組織TNF-α表達的作用，從而說明延緩衰老作用的機理之一可能與提高免疫細胞因子的含量，控制免疫器官的炎性表達作用相關。同時可改善衰老大鼠胸腺和脾臟的組織學超微結構，通過維持細胞形態(tài)的正常，以確保其各項功能的發(fā)揮，從而起到延緩衰老的作用，這可能是其作用途徑之一。研究結果表明，加味四君子湯具有一定的延緩老齡大鼠免疫系統(tǒng)炎性衰老的作用。

本實驗研究了隨著老齡大鼠的衰老變化，加味四君子湯具有延緩大鼠免疫系統(tǒng)衰老的作用，并探討了其可能的作用機理。既為運用提高機體免疫功能原理延緩衰老提供了的理論依據(jù)，又為本復方臨床應用提供了實驗證據(jù);既拓展了中醫(yī)藥防治衰老的思路，亦為該中藥復方制劑的進一步研發(fā)奠定了前期工作基礎。但本研究工作還只是初步研究，還未能進行更加深入的機理探討。如果能應用先進的分子生物學技術，在基因水平上進行深入研究，闡明加味四君子湯更加具體的分子水平的延緩衰老的作用機制，將促進延緩衰老中藥現(xiàn)代機理研究及臨床推廣應用。

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