文婕 殷少軍

銅綠假單胞菌(PA)屬條件致病菌，好發(fā)于免疫力低下者，為院內(nèi)感染的重要病原菌之一[1-2]。老年特別是高齡患者抵抗力減弱，免疫功能低下，呼吸道防御能力削弱，多有基礎疾病和誘發(fā)因素，極易發(fā)生PA肺炎，且發(fā)病后缺乏特異性臨床表現(xiàn)，病死率高，臨床診治存在諸多困難。鑒于人類在體研究的局限性，建立合適的動物模型仍是進行本病研究及篩選治療方案的重要手段。

盡管文獻中有關PA肺部感染的動物模型不少，但這些模型均是不同學者根據(jù)自己的研究領域和研究目的制作的，無論是動物種類、年齡、致病菌菌量還是接種方法等均不相同，很難比較、取舍。為了建立自己的急性老齡PA肺部感染動物模型，我們在借鑒前人經(jīng)驗的基礎上設計了本實驗。擬探討本建模方案的可行性，并通過觀察其病程和病理生理變化，探討該模型的應用價值，以期為后續(xù)的深入研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠60只，鼠齡20～22月，體質量700～900 g，由北京維通利華公司提供，統(tǒng)一編號并按照動物使用條例A-75-10-01進行飼養(yǎng)和實驗。

1.2 菌株來源 PA標準菌株ATCC27853，由復旦大學附屬中山醫(yī)院臨床微生物實驗中心提供。35℃MH瓊脂平板培養(yǎng)24 h，采用麥氏管目測和分光光度儀比色法(波長550 nm，吸光度0.5)，用滅菌蒸餾水配成兩個麥氏單位濃度(6×108cfu/ml)，國內(nèi)外PA誘導動物肺炎模型大多采用此細菌濃度[3-4]。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及建模:將全部大鼠隨機分為實驗組和對照組，每組30只，從中各取20只分別按氣管接種PA后2 h、6 h、9 h、12 h、24 h 分為5 個亞組，每亞組4 只。實驗組大鼠采用3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)行腹腔麻醉后，仰臥，固定于動物手術臺，抬高鼠板頭端，與操作臺面成30°角，減去頸部體毛，用0.5%絡合碘消毒術野，置于超凈工作臺，隨后于頸前正中縱向切開皮膚及皮下組織并向兩側牽開，逐層分離至暴露氣管，在直視下，用一枚頭皮針穿刺兩軟骨環(huán)之間，保持針頭與氣道方向一致，用1 ml無菌注射器取新鮮配置的PA菌液0.2 ml，自頭皮針管緩慢注入，接種后立即拔出針頭，豎立鼠板，保持大鼠直立體位30 s，并輕輕晃動頭部，以確保菌液均勻分布至兩側肺部隨后縫合處理頸部切口，置頭稍高位。對照組大鼠用等體積滅菌生理鹽水(NS)取代PA菌液，余處理同上。另取剩余大鼠(20只)同上建模，用于觀察氣管接種PA后生存率和生存時間。

1.3.2 標本采取與處理:按分組于不同預定時間點對實驗動物進行標本采集與處理:(1)心臟采血，麻醉固定同前，0.5%絡合碘消毒頸部和全胸，置于超凈工作臺，先解剖左側胸壁至肋間肌，見到心臟搏動后，用無菌注射器在心臟取血，置于10 ml真空采血管，4℃保存送檢，并處死大鼠;(2)解剖開胸，觀察雙肺肉眼改變，取右肺下葉部分組織送細菌學培養(yǎng)及菌落計數(shù)，取右肺心葉10%福爾馬林固定，送病理學檢查。

1.4 病原學診斷 取約5 mm×5 mm×5 mm的肺組織塊無菌操作下以研磨器研磨成肺組織勻漿，并置于血瓊脂培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，24 h后觀察計數(shù)。肺炎模型的成功建立依賴于細菌學指標(肺組織勻漿菌落計數(shù))和組織病理學檢查。建模標準，參照Pearson等[5]定義，稍作改動:急性期:(1)肺組織含菌量為 ＞105cfu/g，(2)病理組織學檢查，病理學改變包括:肺組織水腫、纖維蛋白滲出、中性粒細胞浸潤;慢性期:(1)肺組織含菌量為＞103cfu/g，(2)病理組織學檢查，病理學改變包括肺組織實變、纖維增生、淋巴細胞浸潤。

1.5 觀察指標 (1)一般情況:觀察各組大鼠接種后毛色、活動、呼吸、精神狀態(tài)、攝食等一般情況改變;(2)死亡率及死亡時間;(3)全血白細胞分類計數(shù):采用CELL DYN3700全自動血細胞分析儀獸類檢測模式[6];(4)肺組織大體改變:開胸后，肉眼直視觀察;(5)肺組織病理學改變:以10%福爾馬林固定右肺心葉組織，常規(guī)酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后連續(xù)切片，HE染色后光鏡下觀察肺組織病理變化。

1.6 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，所有數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0軟件統(tǒng)計。組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 2組大鼠均于接種后半小時內(nèi)開始出現(xiàn)呼吸急促，搔鼻次數(shù)增多，偶有嗆咳。其中，對照組大鼠的表現(xiàn)于2 h內(nèi)明顯，2～6 h趨于平緩，6 h以后活動增多，呼吸道反應逐漸減弱，毛發(fā)較整齊，至9～12 h接近術前水平，主動多次進食、飲水，反應較靈敏。實驗組大鼠的表現(xiàn)進行性加重，嗆咳明顯，搔鼻增多，呼吸道癥狀于12～16 h趨于平緩，但至24 h仍未恢復接種前水平，全過程均呈現(xiàn)毛發(fā)凌亂，無光澤，精神萎靡，反應遲鈍，活動量及進食量較對照組明顯減少。

2.2 死亡率比較 觀察7 d，對照組大鼠無一死亡，實驗組大鼠4只死亡，分別死于接種后10 h、12 h、18 h、32 h。實驗組死亡率(40%)明顯高于對照組(P＜0.05)。

2.3 肺組織細菌學結果 接種后2 h、6 h、9 h、12 h、24 h，對照組大鼠肺組織均未培養(yǎng)出PA，實驗組大鼠肺組織均培養(yǎng)出PA，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。且隨時間延長，實驗組大鼠肺組織細菌負荷量呈下降趨勢，至24 h達最低，見表1。

2.4 外周血白細胞計數(shù) 接種后，對照組大鼠，外周血白細胞、多形核白細胞(PMN)未見明顯異常。實驗組大鼠，外周血白細胞計數(shù)呈先增后降趨勢，于12 h達高峰，隨后緩慢下降，至24 h仍稍高于對照組，見表2。

表1 2組大鼠氣管接種PA/NS前后肺組織細菌負荷動態(tài)變化(珋，×105 cfu/ml肺勻漿，n=30)

表1 2組大鼠氣管接種PA/NS前后肺組織細菌負荷動態(tài)變化(珋，×105 cfu/ml肺勻漿，n=30)

注:與對照組比較，＊＊P＜0.01

組別2 h 6 h 9 h 12 h 24 h實驗組 2.39±0.39＊＊ 1.95±0.49＊＊ 1.31±0.17＊＊ 1.20±0.22＊＊ 0.58±0.23＊＊對照組00000

表2 2組大鼠氣管接種PA/NS前后外周血白細胞動態(tài)變化(珋，×109/L，n=30)

表2 2組大鼠氣管接種PA/NS前后外周血白細胞動態(tài)變化(珋，×109/L，n=30)

注:與對照組比較，*P＜0.05

項目 實驗組 對照組2 h 白細胞總數(shù) 3.43±0.15*3.20±0.31 PMN 1.03±0.54 0.80±0.26 6 h 白細胞總數(shù) 4.65±2.56* 2.80±0.22 PMN 2.13±1.26 1.00±0.15 9 h 白細胞總數(shù) 6.48±1.46* 2.80±0.27 PMN 2.80±1.41* 0.70±0.11 12 h 白細胞總數(shù) 9.20±1.36* 2.50±0.15 PMN 5.30±1.74* 0.80±0.28 24 h 白細胞總數(shù) 3.67±1.32* 2.50±0.58 PMN 1.43±0.12*0.60±0.42

2.5 肺組織病理學檢查 接種前，2組大鼠肺組織肉眼觀及鏡下表現(xiàn)均未見異常，接種后:(1)標本大體觀察:對照組大鼠雙側肺葉無明顯異常，實驗組大鼠肺組織(上葉及下葉為主)有不同程度水腫、出血、纖維化(斑塊)，9～24 h明顯。(2)鏡下觀察:對照組氣管接種NS后2～6 h，鏡下改變較局限，可見輕微水腫、出血，及少量炎癥細胞聚集，其他各階段均未見明顯異常;實驗組大鼠氣管接種PA后，鏡下改變彌散，且隨時間進展，PMN、單核巨噬細胞聚集增多，肺組織結構破壞嚴重，水腫、出血多見，這些改變以6～24 h明顯，12～24 h達高峰(見圖1)。

圖1 肺組織病理學檢查(HE，×400)

3 討論

當前細菌性肺炎占人類各類病原體肺炎的80%。PA屬條件致病菌，長期應用激素、免疫抑制劑、腫瘤化療、放射治療等導致病人免疫功能低下，以及手術后及某些治療操作后(氣管切開，保留導尿管等)的病人易罹患本菌感染，故亦為醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌之一[7-8]。老年特別是高齡患者，由于特殊生理原因，更易發(fā)生PA肺炎。因此建立老年PA肺部感染的動物模型，并探索其動物模型的診斷標準及觀測指標，對臨床處理老年PA肺炎有重要價值。

為能模擬臨床免疫功能降低病人感染PA后的炎癥反應及其特點，國內(nèi)學者李倬哲等[3]于2001年成功建立粒細胞減少大鼠PA肺炎動物模型。該模型，采用糖皮質激素聯(lián)合環(huán)磷酰胺共同作用造成大鼠免疫功能下降、粒細胞減少。在此基礎上，適宜濃度的PA菌液經(jīng)氣管接種大鼠，以模擬臨床上常見的粒細胞缺少患者的肺部感染。此外，也有部分學者根據(jù)自己研究領域和研究目的不同，建立專門針對老齡動物的肺部細菌感染模型[9-10]，但鑒于研究目的不同，在實驗動物選擇、年齡、接種劑量及接種方式上各不相同，各種方法之間，難以比較取舍。本實驗在借鑒前人經(jīng)驗的基礎上，結合整體實驗研究目的，采用前述方法建立自己的急性老齡PA肺炎動物模型，在探討建模方法可行性的同時，以期為老齡PA肺炎動物模型的建立提供新的思路。

同時，考慮到本課題組主要研究方向，為能與青年動物模型間進行良好比較，進而在此基礎上探索比較青年PA與老年PA肺炎患者在病理生理、生化等各方面的改變，為老齡PA肺炎的深入研究和探索更為合理有效的治療手段奠定基礎。因此，在接種劑量的選擇上，我們并未進行劑量梯度實驗，而是選用了目前國內(nèi)外誘導青年大鼠PA肺部感染模型的常用劑量，以探討該劑量誘導老齡動物模型的可行性。所以，本實驗的不足之處在于無法進行不同建模劑量之間的橫向比較，以提供更好的選擇，關于該問題，我們會在后續(xù)實驗中不斷完善。

另外，為使所建動物模型與臨床急性老齡PA肺炎的肺部炎癥發(fā)病過程，病理變化和細菌指標更為接近，本實驗在菌種選擇、無菌手術操作方面嚴格遵循相關原則。實驗結果參照Pearson等[5]定義建模標準，結合本實驗細菌學(肺組織勻漿菌落計數(shù))和組織病理學研究數(shù)據(jù)，以及相關輔助數(shù)據(jù)，表明:應用經(jīng)氣管切開法接種PA標準菌液(ATCC27853，6×108cfu/ml，0.2 ml)可成功建立老年大鼠急性PA肺部感染模型，為臨床研究和控制老年急性PA肺部感染提供了基礎資料，具有重要參考價值。有關老齡大鼠PA肺部感染相關炎性因子表達及其機制尚待進一步研究。

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