周 英，李 健，呂文彬，陳 雪，王乃紅，迭 敏

（成都市血液中心，四川 成都610041）

Rh血型在臨床輸血中具有重要意義，也是人類紅細胞血型系統(tǒng)中最為復雜、最具多態(tài)性的系統(tǒng)，其中RhD抗原因其能引起溶血性輸血反應及新生兒溶血病而倍受重視［1］。新生兒溶血?。℉DN）是由于母嬰血型不合，母體血中存在與胎兒血型抗原相應的免疫性抗體（IgG型），此種特異性抗體可通過胎盤進人胎兒，引起胎兒紅細胞破壞而發(fā)生溶血，并伴隨一系列病理損害，如黃疽，貧血，肝脾腫大等癥狀［2］。在我國，ABO血型不合導致新生兒溶血較多見，病情較輕；Rh（D）血型不合導致新生兒溶血較少見，但病情較重，具有黃疸出現(xiàn)早，發(fā)展迅速，病情危重等特點，易致死與致殘，它的治療的關鍵在于早發(fā)現(xiàn)，早預防，早治療［3］。因此，較早對 Rh（D）陰性孕婦進行胎兒是否發(fā)生Rh（D）血型不合導致新生兒溶血的評估顯得尤為重要。目前預防、診斷Rh（D）血型不合導致新生兒溶血病的基礎是檢測胎－母出血量［4］，采用血清學方法定性檢測母體是否被胎兒紅細胞致敏。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，流式細胞術(shù)能對血液中微量細胞群進行定性及定量的分析，具有速度快、精度高、準確性好等特點；有資料顯示，通過流式細胞儀計數(shù)胎兒紅細胞的數(shù)量，此方法靈敏度可達0.001%，是目前檢測胎兒紅細胞的最佳方法［5］。本研究采用相關文獻［1］中建立的流式細胞術(shù)檢測Rh（D）血型不合導致新生兒溶血病，探討其在產(chǎn)前診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象

經(jīng)Rh（D）抗原初篩實驗為陰性的醫(yī)院送檢孕婦標本30例，妊娠周期為20～38周，年齡為18～35周歲，其中27例在孕期大于32周后追蹤檢測2次。

1.2 試劑與儀器

抗－D（IgG）單克隆抗體（上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司，效價1：32，批號20070119），RhD（IgM＋IgG）單克隆抗體（Biotest，德國，批號1110906），抗－D（IgM＋IgG）單克隆抗體（Dominion公司，加拿大，批號 NDMG04203），抗－D（IgM＋IgG）單克隆抗體（Celliance公司，英國，批號BMJ0506G），廣譜抗人球蛋白試劑（上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司，批號20061221），F(xiàn)ITC－抗人IgG（γ），F(xiàn)（ab’）2純化抗體（KPL公司，美國，批號2021002），EPICS XL流式細胞儀（COULTER，美國），CX41顯微鏡（OLYMPUS），三用電熱恒溫水溫箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）。

1.3 方法

1.3.1 Rh表型血清學鑒定 RhD初篩及陽性判定按照《中國輸血技術(shù)操作規(guī)程》操作，RhD初篩陰性者的紅細胞分別與4種不同廠家和批號的單克隆抗－D做間接抗人球蛋白試驗（IAT），設陰性及陽性對照。與4批抗－D反應全部無凝集者判定為RhD陰性。

1.3.2 流式細胞術(shù)檢測用紅細胞的制備 取待檢孕婦紅細胞500μl，磷酸鹽緩沖液（PBS，PH7.4）洗滌3遍，配成細胞懸液，顯微鏡計數(shù)紅細胞的濃度，調(diào)細胞濃度為1×106／μl。同時設RhD陽性對照和陰性對照管。

1.3.3 流式細胞術(shù)分析 待檢孕婦紅細胞懸液（細胞濃度為1×106／μl）50μl，加人源單克隆IgG 抗－D（批號20070119）50μl混勻，37℃孵育30min，PBS洗滌3遍，加 FITC－抗人IgG（γ），F(xiàn)（ab’）2純化抗體15μl（濃度為3μg／15μl），室溫避光反應30min，PBS洗滌3遍，細胞以500uLPBS重懸，上機檢測。根據(jù)前向角散射（FSC）與側(cè)向角散射（SSC），設定“門”，使紅細胞與血小板、細胞碎片區(qū)別開來。收集50000個細胞，記錄光散射及熒光數(shù)據(jù)。每次測定前以Flowcheck調(diào)整儀器的光路和流路。

1.3.4 確定陰性閾值 取5份RhD陰性標本（經(jīng)查證為未孕女性）作為陰性對照細胞，處理方法如上所示。對其紅細胞懸液進行流式細胞術(shù)檢測，以陽性反應細胞百分數(shù)均值（±2s）設定陰性閾值。

1.3.5 患兒標本血清學檢測HDN 在30例陰性孕婦產(chǎn)后，取患兒血液標本，采用血清學方法進行紅細胞直接抗人球蛋白試驗、抗體篩選或抗體鑒定試驗。根據(jù)試驗結(jié)果判定患兒是否為HDN（患兒Rh血型均為陽性）。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS12.0進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 血型血清學結(jié)果

經(jīng)Rh（D）抗原確認試驗，陰性孕婦標本為30例。

2.2 Rh（D）陰性孕婦血液中胎兒微量Rh（D）紅細胞流式細胞術(shù)檢測與患兒標本血清學檢測結(jié)果比較，見表1。

表1 Rh（D）陰性孕婦血液中胎兒微量Rh（D）紅細胞流式細胞術(shù)檢測與患兒標本血清學檢測結(jié)果比較

2.3 追蹤檢測兩次27例Rh（D）陰性孕婦血液中胎兒微量Rh（D）紅細胞比例，見表2。

表2 追蹤檢測兩次27例Rh（D）陰性孕婦血液中胎兒微量Rh（D）紅細胞流式細胞術(shù)檢測值比較

3 討論

Rh血型系統(tǒng)是人類血型中最具多態(tài)性和免疫遺傳特性的一個系統(tǒng)，迄今已發(fā)現(xiàn)含有49個獨立的抗原，是輸血醫(yī)學中除ABO血型之外最具臨床意義的一個血型系統(tǒng)。RhD抗原的高免疫原性常常會引起胎兒和新生兒溶血?。℉DN）、溶血性輸血反應和自身免疫性溶血性貧血等疾?。?，7］。HDN是臨床常見的因母嬰血型不合導致新生兒溶血病，可以引起高膽紅素血癥、貧血等。雖然Rh（D）血型不合導致新生兒溶血病發(fā)生的機率較少，但其后果嚴重，孕期易導致流產(chǎn)、死胎，新生兒極易發(fā)生黃疸、水腫、貧血、肝脾腫大及膽紅素腦病，甚至死亡。在產(chǎn)前對Rh（D）陰性孕婦進行有效地評估顯得尤為重要。

本次研究采用流式細胞術(shù)檢測30例Rh（D）陰性孕婦血液中胎兒微量Rh（D）紅細胞；在孕婦產(chǎn)后取患兒血液標本，采用血清學方法進行新生兒溶血病的檢測。兩組數(shù)據(jù)由表1可以看出，Rh（D）血型不合，流式細胞術(shù)檢測與血清學檢測結(jié)果比較差異不顯著。有文獻報道［8］，Rh血型不合 HDN，由于RH抗原位點多且抗原決定簇在細胞外暴露多，比較容易被檢出，因此流式法和試管法的檢測陽性率均為100%。此次研究結(jié)果與報道基本相符。

胎兒細胞在母體內(nèi)具有一定的消長規(guī)律。利用檢測母親外周血胎兒紅細胞進行非創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷的最佳時間一直存在爭議。但目前普遍認為，理想時間為早期和中期妊娠［9］。Sonda等［10］利用 CD71和GPA雙抗體經(jīng)FACS技術(shù)證實NRBC的濃度在孕7～l8周最高。我們對孕婦體內(nèi)胎兒微量Rh（D）紅細胞所占比例進行了追蹤檢測，由表2可以看出追蹤檢測兩次的數(shù)據(jù)比較差異不顯著。本次研究由于條件限制，僅對孕婦進行了2次追蹤檢測，在今后的研究中還可以進行更詳細的追蹤檢測，有待進一步探討。

本次研究的數(shù)據(jù)顯示，運用流式細胞術(shù)檢測妊娠24周左右的Rh（D）陰性孕婦血液中胎兒微量Rh（D）紅細胞的方法，能較早預測新生兒溶血病發(fā)生的可能性，在一定程度上有助于新生兒溶血病的早期預防、治療、診斷，為抗D引起新生兒溶血病患兒的換血治療贏得了寶貴時間，減少了出現(xiàn)嚴重后遺癥的可能性。本研究具有靈敏度較高、實驗結(jié)果易于判定、實驗的準確度和重復性較好等優(yōu)點，在臨床上有較大的運用價值。建議Rh（D）陰性孕婦在24周左右常規(guī)做流式細胞術(shù)檢測，為Rh（D）血型不合導致新生兒溶血病提供了一種早期預防﹑診斷的可靠依據(jù)，具有一定的社會效益和經(jīng)濟效益。

［1］周 英，陳 雪，李健等.流式細胞術(shù)檢測RhD（－）血液中微量D（＋）紅細胞的研究［J］.中國輸血雜志，2008，21（5）：346－348.

［2］萬艷紅.“O”型孕婦產(chǎn)前免疫學檢測對判斷新生兒溶血病價值的探討［J］.中國實用醫(yī)藥，2007，2（2）：47.

［3］楊江存，韓梅寧，張獻清.Rh血交換治療32例新生兒溶血病分析［J］.第四軍醫(yī)大學學報，2005，26（24）：2280.

［4］Moise KJ.Red blood cell alloimmunization in pregnancy［J］.Semin Hematol.2005，42（3）：169.

［5］王建中，臨床流式細胞分析［M］.上海：上?？茖W技術(shù)出版社，2005.372.

［6］Avent ND，Reid ME.The Rh blood group system：a review［J］.Blood，2000，95（2）：375.

［7］Urbaniak SJ.Alloimmunity to RhD in humans［J］.Transfus clin Biol.2006，13（1－2）：19.

［8］戎 霞，羅廣平，付涌水，等.流式細胞術(shù)在母嬰血型不合新生兒溶血病檢測中的應用［J］.熱帶醫(yī)學雜志，2008，8（8）：791－793.

［9］陳漢平，沈 怡，張漢鳳等.運用流式細胞技術(shù)分析孕婦外周血中胎兒有核紅細胞的比例與孕周的關系［J］.實用婦產(chǎn)科雜志，2002，3（18）：104.

［10］Sonda Sa1cshi.Arinam T Hanada H，et al.The proportion of fetal Nucleared red blood cells in maternal blood：estimation by FACS Analysis Prenat Diagn［J］.Blood，1997，17：743.