王 寧，姜海容，劉 潔，閻 英

（1.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院 放療科，沈陽(yáng)110015；2.長(zhǎng)春市中心醫(yī)院 腫瘤科，長(zhǎng)春130051；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心，沈陽(yáng)110001）

垂體瘤轉(zhuǎn)化基因（pituitary tumor transforminggene，PTTG）與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［1］。近來(lái)有研究證實(shí)人胰腺癌中PTTG也存在高表達(dá)［2］，但PTTG對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖及調(diào)控機(jī)制的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用小干擾RNA下調(diào)PTTG基因表達(dá)，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料

人胰腺癌PANC－1由中科院上海細(xì)胞生物研究所提供。siRNA－PTTG和陰性對(duì)照siRNA由Qiagen公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及基因沉默效應(yīng)檢查 將PANC－1細(xì)胞分為3組（①.未轉(zhuǎn)染PANC－1細(xì)胞、②.轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA、③轉(zhuǎn)染siRNA－PTTG）。基因沉默效應(yīng)檢查詳見(jiàn)另文［3］。

1.2.2 形態(tài)觀察及細(xì)胞增殖測(cè)定 倒置顯微鏡觀察不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，濃度為1×105個(gè)／ml，96孔板每孔接種100μl細(xì)胞懸液，5%CO2，37℃孵育24 h后，吸去培養(yǎng)上清，用無(wú)血清opti－MEM輕洗兩次后進(jìn)行基因沉默，6h后換上新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液100 μl／孔，分別收集轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h和96h的細(xì)胞，距離時(shí)間點(diǎn)結(jié)束4h時(shí)小心吸去上清，加入80μl無(wú)血清培養(yǎng)液，再加入2 0μl MTT溶液（5mg／ml）繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后吸掉上清，每孔加入150μl二甲基亞砜，搖床低速振蕩10min，充分溶解結(jié)晶物，混勻后于酶標(biāo)儀于570nm處讀取各孔吸光度（A570值），每組設(shè)定5個(gè)復(fù)孔。

1.2.33H－TdR測(cè)定DNA合成 胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，濃度為1×105個(gè)／ml，96孔板每孔接種100μl細(xì)胞懸液，5%CO2，37℃孵育24h后，吸去培養(yǎng)上清，用無(wú)血清opti－MEM輕洗兩次后進(jìn)行基因沉默，48h后加入1.0μCi／孔3HTdR，繼續(xù)培養(yǎng)6h，然后收獲細(xì)胞于玻璃纖維濾膜上，抽洗至少2次，60℃－80℃烤干后，將濾膜放入裝有4ml閃爍液的閃爍瓶中，暗處放置15min，MicroBeta Trilux 1450液閃和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)定各管每分鐘脈沖計(jì)數(shù)（Count percent minute，cpm）計(jì)算抑制率。抑制率（%）＝（對(duì)照組CPM值－實(shí)驗(yàn)組CPM值）／對(duì)照組CPM值×100

1.2.4 細(xì)胞周期分析 轉(zhuǎn)染后48h，收集細(xì)胞，用70%乙醇4℃固定24h，加入RNA酶（終濃度50 μg／ml），37℃反應(yīng)1h，加入碘化丙啶 （PI，100μg／ml）溶液染色20－30min后，在BD流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，多樣本均數(shù)間兩兩比較用q檢驗(yàn)，取P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA－PTTG 對(duì) PANC－1細(xì)胞增殖能力的影響

倒置顯微鏡下可見(jiàn)未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA的PANC－1細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，形態(tài)未見(jiàn)差別，皆為致密貼壁生長(zhǎng)多角形，細(xì)胞輪廓清晰，伸展良好，折光性強(qiáng)胞漿內(nèi)未見(jiàn)顆粒和空泡。經(jīng)siRNA－PTTG處理的PANC－1細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，體積減小，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，脫落和懸浮細(xì)胞增多，細(xì)胞質(zhì)回縮，折光率下降。

轉(zhuǎn)染siRNA－PTTG后各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞吸光度低于未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；未轉(zhuǎn)染和陰性對(duì)照組細(xì)胞吸光度值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 MTT分析不同組PANC－1細(xì)胞的吸光度值

2.2 siRNA－PTTG 對(duì)3 H－TdR 摻入PANC－1細(xì)胞DNA合成的影響

siRNA－PTTG組3H－TdR摻入率的放射性計(jì)數(shù)明顯低于未轉(zhuǎn)染PANC－1細(xì)胞和轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA組，其DNA合成抑制率為37.87%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)表2），表明PTTG基因下調(diào)能夠抑制細(xì)胞DNA合成。

表2 siRNA－PTTG 對(duì)3 H－TdR摻入PANC－1細(xì)胞DNA合成的影響

2.3 siRNA－PTTG對(duì)PANC－1細(xì)胞周期的作用

與未轉(zhuǎn)染PANC－1細(xì)胞和轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染siRNA－PTTG后G0／Gl期細(xì)胞百分率升高為58.96±12.14，顯著高于陰性對(duì)照組的39.42±9.45和未轉(zhuǎn)染 PANC－1細(xì)胞組的36.75±10.28，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染siRNA－PTTG后S期比例下降為28.41±6.78，顯著低于陰性對(duì)照組的43.39±12.05和未轉(zhuǎn)染PANC－1細(xì)胞組的42.21±11.74，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），具體結(jié)果詳見(jiàn)表2。未轉(zhuǎn)染PANC－1細(xì)胞和轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA相比，G0／G1期及S期比率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)果提示，siRNA－PTTG顯著抑制PANC－1細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期阻抑在G0／G1期，DNA合成顯著降低。

3 討論

胰腺癌是惡性度較高的胃腸道腫瘤，發(fā)病率逐年上升，常規(guī)治療方法效果有限，探尋新的治療方法具有重要意義。隨著RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)該方法沉默癌基因表達(dá)在胰腺癌治療上顯示出巨大的優(yōu)勢(shì)［4］。PTTG基因是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的在多種腫瘤組織中異常表達(dá)的一種癌基因［1］，其在胰腺癌中的表達(dá)高于癌旁組織、胰腺良性腫瘤和正常胰腺組織，并和胰腺癌侵襲，分化相關(guān)［5］，但尚沒(méi)有研究證明其和胰腺癌增殖的關(guān)系。

表3 siRNA－PTTG對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期影響

PTTG與腫瘤細(xì)胞增殖關(guān)系密切，現(xiàn)有的研究表明其在不同的腫瘤，不同的生理病理?xiàng)l件下，可能發(fā)揮不同的作用，結(jié)果間存在很大差異。由于PTTG編碼的securin具有抑制姐妹染色單體分離的功能，其過(guò)表達(dá)可能會(huì)通過(guò)延遲有絲分裂、抑制姐妹染色單體分離從而抑制細(xì)胞增殖［6］。還有研究報(bào)道其還可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)其抑制細(xì)胞增殖的作用［7］。一些動(dòng)物模型和細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)均證實(shí)如此。研究發(fā)現(xiàn)小鼠成纖維細(xì)胞系3T3高表達(dá)PTTG蛋白可抑制細(xì)胞增殖并引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化，成瘤性降低［8］；將hPTTG轉(zhuǎn)染至HeLa和A549細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖受到明顯抑制［9］。與此相反，另一些實(shí)驗(yàn)卻發(fā)現(xiàn)PTTG作為一種細(xì)胞轉(zhuǎn)化癌基因，具有激活增殖的功能。在垂體腺瘤和平滑肌瘤，PTTG表達(dá)與細(xì)胞增殖相關(guān)標(biāo)志－增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）或Ki－67表達(dá)高度相關(guān)［10，11］。在鼠垂體成瘤模型［12］和甲狀腺濾泡癌［13］，PTTG缺失可導(dǎo)致垂體和甲狀腺細(xì)胞增殖減低。垂體細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和培養(yǎng)的子宮肌瘤細(xì)胞中PTTG表達(dá)水平與增殖活力成正相關(guān)［14，15］。使用基因敲除技術(shù)使PTTG缺失的研究也證實(shí)在骨髓干細(xì)胞、膠質(zhì)瘤、肉瘤、肝癌和促皮質(zhì)激素細(xì)胞中PTTG具有刺激增殖的作用［16，17］。盡管 Kim 等［13］研究發(fā)現(xiàn) PTTG 可以誘導(dǎo)甲狀腺濾泡癌細(xì)胞系FTC133增殖，但Saez［18］和Boelaert等［19］的研究則認(rèn)為PTTG與甲狀腺癌細(xì)胞增殖之間無(wú)相關(guān)性。

本研究利用化學(xué)合成的siRNA沉默PANC－1細(xì)胞內(nèi)PTTG表達(dá)，經(jīng)RT－PCR和Western blot證實(shí)其沉默效應(yīng)［3］。倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)siRNA－PTTG處理的PANC－1細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，體積減小，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，脫落和懸浮細(xì)胞增多，細(xì)胞質(zhì)回縮，折光率下降。這些細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化提示經(jīng)siRNA－PTTG處理后的PANC－1細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。MTT比色法結(jié)果顯示，siRNA－PTTG組各時(shí)間點(diǎn)的吸光度值均下降，細(xì)胞增殖速度明顯降低，而未轉(zhuǎn)染和陰性對(duì)照siRNA組增殖速率相近，吸光度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3H－TdR摻入實(shí)驗(yàn)表明未轉(zhuǎn)染PANC－1細(xì)胞和轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組放射性計(jì)數(shù)明顯高于siRNA－PTTG組，表明PTTG基因沉默能夠抑制PANC－1細(xì)胞DNA合成。細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染siRNA－PTTG后G0／Gl期細(xì)胞百分率顯著增加，S期顯著降低。由此可見(jiàn)，PTTG具有促進(jìn)體外培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞增殖的作用，其表達(dá)下調(diào)可通過(guò)抑制DNA合成導(dǎo)致細(xì)胞增殖下降。因此，PTTG有望成為胰腺癌早期診斷和基因治療的新靶點(diǎn)，但其調(diào)控細(xì)胞增殖的確切機(jī)制和路徑仍有待于進(jìn)一步研究。

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