張 濟，李 羿，李君君，顏家運，劉 靜

（1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院 血液科，湖南 衡陽421001；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)研究中心，湖南 長沙410078；3.空軍雷達學(xué)院宜昌校區(qū)衛(wèi)生隊，湖北 宜昌443111）

急性早幼粒細胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）是一種特殊類型的急性白血病，發(fā)病率占急性白血病的6%－9%，在中國人群中約占急性髓系白血病的12%－23%［1］。70%－90%的APL具有特征性的染色體易位t（15；17）（q22；q12）及其產(chǎn)生的PML－RARα融合蛋白，是APL特有的分子遺傳性學(xué)標(biāo)志。此類白血病細胞可被全反式維甲酸（all trans retinoic acid，ATRA）誘導(dǎo)分化成熟，國內(nèi)外許多研究學(xué)者［2－4］研究報道ATRA 和As2O3聯(lián)合治療急性早幼粒細胞白血病，可有效根除白血病細胞的惡性克隆，完全緩解率（CR）達85%－90%。本研究通過RT－PCR和熒光原位雜交技術(shù)檢測ATRA及As2O3聯(lián)合治療APL后體內(nèi)PML－RARα融合基因的表達水平變化，監(jiān)測APL患者體內(nèi)微小殘留白血病的情況，為及時臨床用藥及預(yù)后評估提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 對象 20例正常對照組為健康人群，男13人，女7人，年齡在15－62歲，中位年齡為38歲。46例APL患者為2008年6月至2010年6月我院診治的病人，APL的診斷均依據(jù)FAB的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］，其中男26例，女20例，年齡16－65歲，中位年齡38歲。

1.2 治療方法 將0.1%As2O3注射液10ml加入50g／L葡萄糖溶液500ml中，靜脈點滴，持續(xù)4－6h；ATRA 25mg.m－2.d－1，口服，直至達完全緩解（CR）。完全緩解（CR）后再接受3個療程化療。

1.3 熒光原位雜交檢測PML－RARα融合基因采用北京金菩嘉公司提供的雙色雙融合DNA探針，實驗操作參考操作說明及文獻資料［6］進行，結(jié)果觀察在OLYMPUS－BX51型熒光顯微鏡下觀察計數(shù)1000個細胞。正常細胞信號顯示方式為2紅2綠，PML－RARα融合基因融合基因陽性細胞為2紅1綠1黃。

1.4 RT－PCR 檢測 PML－RARα融合基因 采用TRIZOL試劑嚴(yán)格按操作說明提取患者總RNA，采用cDNA合成試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用一對特異的PML－RARα融合基因引物擴增該融合基因，上游引物：5＇ACCGAT GGCTTCGACGAGTTC 3＇，下游引物：5＇AGCCCTTGCAGCCCTCACAG 3＇；PCR參數(shù)設(shè)置為：94℃變性35秒，55℃退火1分鐘，72℃延伸3分鐘，反應(yīng)30個循環(huán)，最后1周期后72℃延伸10分鐘，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 運用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)資料采用配對四格表資料檢驗（Mc－Nemar test）進行差異分析，檢驗水準(zhǔn)為α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 治療前骨髓細胞形態(tài)學(xué)與PML－RARα融合基因檢測

46例患者初診時骨髓細胞學(xué)檢查為典型的APL骨髓象，異常早幼粒細胞占骨髓有核細胞的78.4±16.2%，RT－PCR及 FISH 技術(shù)檢測 PMLRARα融合基因均為陽性，其中2例初發(fā)患者因并發(fā)彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）搶救無效死亡。

2.2 微小殘留白血病的檢測

2.2.1 誘導(dǎo)緩解后 PML－RARα融合基因的檢測

經(jīng)全反式維甲酸和三氧化二砷聯(lián)合治療后骨髓象達到完全緩解，其中34例APL患者PML－RARα融合基因檢測結(jié)果見表1，25例經(jīng)RT－PCR和FISH檢測均呈陰性，1例患者緩解后未能嚴(yán)格按化療方案堅持治療，疾病復(fù)發(fā)而死亡，另外1例患者失去隨訪資料，其余病人一直處于緩解狀態(tài)，因此該融合基因陰性復(fù)發(fā)APL的預(yù)測值為4.3%。9例PML－RARα融合基因陽性患者，3例FISH檢測呈陰性，F(xiàn)ISH的陽性檢測失敗率為33.3%；1例RTPCR檢測呈陰性而FISH檢測呈陽性，其檢測失敗率為11.1%，兩法檢測的靈敏度無顯著差異（χ2＝0.25，P＞0.05）。融合基因陽性患者中4例患者最終復(fù)發(fā)APL，因此在此階段PML－RARα融合基因檢測陽性而復(fù)發(fā)APL的預(yù)測值為44.4%。

表1 誘導(dǎo)緩解后PML－RARα融合基因檢測結(jié)果

2.2.2 鞏固及維持治療后PML－RARα融合基因的檢測 APL患者治療達CR，再經(jīng)過連續(xù)3個月鞏固化療后，31例具有完整病歷資料APL患者的PML－RARα融合基因檢測結(jié)果見表2，27例融合基因陰性患者至今持續(xù)達到分子生物學(xué)緩解，無復(fù)發(fā)病例。4例PML－RARα融合基因陽性患者，2例FISH檢測示陰性（陽性檢測失敗率為50%）；1例RT－PCR檢測示陰性（陽性檢測失敗率為25%），3例患者最終復(fù)發(fā)APL，1例患者經(jīng)治療后緩解，因此在此階段其融合基因陽性復(fù)發(fā)APL的預(yù)測值為75%。

表2 鞏固維持治療后PML－RARα融合基因檢測結(jié)果

3 討論

MRD是指白血病經(jīng)過治療達到完全緩解（CR）后體內(nèi)殘留白血病細胞的狀態(tài)，它是導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)的主要根源。因此，MRD的早期檢測是防止白血病復(fù)發(fā)和提高患者長期生存率的重要措施。MRD的檢測方法包括細胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細胞遺傳學(xué)、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）等。APL患者化療前白血病細胞總數(shù)＞1012，化療緩解后減少到108，形態(tài)學(xué)方法就難以檢出MRD，常規(guī)細胞遺傳學(xué)分析因分裂相數(shù)量和質(zhì)量的限制，因此也不是檢測MRD的敏感方法。PML－RARα融合基因是APL特征性的分子遺傳學(xué)標(biāo)志，對疾病的診斷、治療及預(yù)后評估具有非常重要的臨床價值。RT－PCR和FISH技術(shù)是臨床上非常有效的PML－RARα融合基因檢測技術(shù)，APL患者經(jīng)ATRA和As2O3聯(lián)合治療后PML－RARα融合基因陰性的患者，僅有1例在誘導(dǎo)化療結(jié)束后該融合基因呈陰性的患者在2年內(nèi)出現(xiàn)了復(fù)發(fā)，在此階段基因檢測陰性復(fù)發(fā)APL的預(yù)測值僅為4.3%，而PML－RARα陽性復(fù)發(fā)APL的預(yù)測值為44.4%；而經(jīng)鞏固和維持治療后，融合基因陰性的患者尚未見復(fù)發(fā)病例，PML－RARα陽性而復(fù)發(fā)APL的幾率（75%）較誘導(dǎo)化療結(jié)束時高，因此，PML－RARα基因陰性提示非常低的APL復(fù)發(fā)概率，而陽性則預(yù)示著較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險。Joseph等［7］研究結(jié)果顯示PML－RARα融合基因檢測2次以上陰性患者者，僅7%的患者發(fā)生復(fù)發(fā)，而2次以上陽性者，100%復(fù)發(fā)。

RT－PCR和FISH技術(shù)在實際應(yīng)用過程中都存在各自的局限性，在發(fā)生隱性易位（包括插入易位和復(fù)雜易位）的患者中，若不使用特異性位點探針，F(xiàn)ISH檢測結(jié)果常為陰性［8］，本研究結(jié)果顯示在誘導(dǎo)緩解和鞏固維持治療后其陽性檢測失敗率分別為33.3%和50%。而在RT－PCR反應(yīng)體系中，高質(zhì)量的RNA及高效的逆轉(zhuǎn)錄是實驗成功的關(guān)鍵步驟［9］，若提取的RNA數(shù)量及質(zhì)量達不到實驗要求則是引起實驗失敗的主要原因，在前后兩次檢測中RT－PCR的陽性檢測失敗率分別為11.1%和25%，因而比較而言，RT－PCR對APL患者MRD監(jiān)測的靈敏度較FISH稍高，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而FISH相對要求的分析細胞數(shù)量較少，且無論是分裂間期還是分裂期細胞均可獲得準(zhǔn)確結(jié)果，特異性高。因此，在實際臨床實踐中可使它們相互補充，可得到更全面準(zhǔn)確的實驗結(jié)果。

綜上所述，RT－PCR和FISH技術(shù)是兩種重要的監(jiān)測APL患者體內(nèi)PML－RARα融合基因表達情況的技術(shù)方法，準(zhǔn)確而及時的PML－RARα融合基因的檢測結(jié)果不僅對APL患者疾病的診斷具有重要價值，而且在APL患者微小殘留病灶的監(jiān)測發(fā)揮重要作用，并指導(dǎo)臨床及時進行藥物干預(yù)治療，提高患者的長期生存率及改善患者生活質(zhì)量。

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