劉 建，湯德元*，羅險(xiǎn)峰，曾智勇，李春燕，甘振磊，王 鳳，郝 飛，王洪光

（ 1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550008）

副 豬 嗜 血 桿 菌（Haemophilus parasuis，HPS）是健康豬上呼吸道常見的一種細(xì)菌，主要定植在鼻黏膜和（或）扁桃體區(qū)域[1]，在受到外界刺激下，HPS 可以突破鼻黏膜的屏障遷移到肺部，造成肺炎，而且會(huì)進(jìn)一步的傳播導(dǎo)致嚴(yán)重的全身性疫病，主要以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎為特征，咬肌炎較少見[2-3]，這種病被稱為副豬嗜血桿菌病或格拉澤氏病。副豬嗜血桿菌只感染豬，主要發(fā)生在斷奶前后和仔豬階段，多見于5～8 周齡的仔豬，一些應(yīng)激因素，如長距離運(yùn)輸，惡劣的飼養(yǎng)的環(huán)境以及哺乳仔豬斷奶過早等，對副豬嗜血桿菌的流行有一定影響[4]，該病發(fā)病率一般在10%～15%，嚴(yán)重時(shí)死亡率則高達(dá)50%[5]。HPS 是導(dǎo)致規(guī)模化養(yǎng)豬廠仔豬發(fā)病死亡的主要原因之一，在過去的幾年里，給現(xiàn)代化養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。外膜蛋白（Outer-Membrane Protein，OMP）、莢膜多糖、脂多糖、神經(jīng)氨酸酶、轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白、毒素蛋白等都是HPS 的主要毒力因子[7]，均可導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病。通過對完全獲得HPS 免疫保護(hù)的動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體并未產(chǎn)生針對脂多糖和莢膜多聚糖的抗體，僅產(chǎn)生了具有中和外膜蛋白作用的抗體，證明外膜蛋白具有更強(qiáng)的免疫原性。本實(shí)驗(yàn)通過PCR 技術(shù)擴(kuò)增HPS 的OMP2 基因，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對OMP2 基因及其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)及功能的分析，為研制檢測 HPS 抗體的間接 ELISA 試劑盒以及 HPS 基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種、感受態(tài)細(xì)胞和載體

副豬嗜血桿菌陽性病料采自貴州省安順地區(qū)某規(guī)模化養(yǎng)豬場，經(jīng)PCR 鑒定為陽性及間接血凝試驗(yàn)鑒定為血清型5 型后，-20℃保存；pMD18-T Vector 購自大連寶生物工程有限公司；基因工程菌E.coliTop10 感受態(tài)細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)保存。

1.2 主要試劑

Taq DNA聚合酶、dNTPs、10×PCR Buffer、Rnase Free H2O、BamH Ⅰ和 Sal Ⅰ限制性內(nèi)切酶、DL2000 DNA Marker、Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0提取試劑盒等購自大連寶生物工程有限公司；Amp、IPTG、X-gal 購于美國Sigma 公 司；GoldView 購于Hyclone公司；E.Z.N.A.Gel Extraction Kit DNA 凝膠回收試劑盒和E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit 質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA 公司；瓊脂糖，購自Biowest公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)副豬嗜血桿菌SH0165株OMP2 基因序列(登錄號：NC_011852)，用生物軟件Premier Primer5.0 和Oligo6.0 軟件設(shè)計(jì)1對特異性引物，擴(kuò)增HPS OMP2 的全基因。引物序列如下：上游引物P1:5′-CGGGATCCATGAAAAAA ACACTAGTAGCA-3′ (下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn))；下游引物P2:5′-GCGTCGACTTACCATAAT ACACGTAAACCA-3′(下劃線部分為SalⅠ酶切位點(diǎn))，預(yù)計(jì)擴(kuò)增基因片段大小為1092 bp。引物由大連寶生物公司合成。

1.4 副豬嗜血桿菌OMP2 基因的擴(kuò)增

用Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 提取試劑盒提取副豬嗜血桿菌陽性病料基因組DNA，以此為模板，以P1 和P2 為引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系如下：10×PCR Buffer （含Mg2+）5μL、dNTP Mixture( 各2.5mM) 4μL、 上下游引物各2μL、Taq DNA 聚合酶1μL、DNA 模板4μL、加Rnase Free H2O 至總體積為50μL。PCR 反應(yīng)條件 為：94℃預(yù) 變 性5min；94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 45s，共35 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.5 副豬嗜血桿菌OMP2 基因的克隆與鑒定

將回收純化的OMP2 基因與pMD18-T 載體連接，連接反應(yīng)體系為：pMD18-T 載 體1μL、目的DNA 片 段3 μL 和Solution Ⅰ6 μL，16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliTop10 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含IPTG和X-gal 的2×YT 瓊脂平板（含 氨芐青霉素50 μg/mL）上，37℃恒溫培養(yǎng)12～16 h，挑取單個(gè)白色菌落接種于2×YT 液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素50μg/mL） 中，37℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)16～18 h，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng) BamH I 和Sal Ⅰ雙酶切鑒定正確后，將陽性克隆質(zhì)粒命名為pMD18-T-OMP2，并送上海英駿生物技術(shù)公司測序。

1.6 副豬嗜血桿菌OMP2 基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

利用 DNAMAN、MEGA、DNAStar 軟件及互聯(lián)網(wǎng)上的分析軟件，對所克隆的OMP2 基因進(jìn)行核苷酸序列、編碼的氨基酸序列、蛋白分子理化特性征、信號肽、跨膜區(qū)、抗原表位及蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析。

2 結(jié)果

2.1 OMP2 基因擴(kuò)增結(jié)果

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條帶約為1092 bp（圖1），與預(yù)期片段大小相符。

圖1 OMP2 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

將回收純化的后的PCR 產(chǎn)物與pMD18-T 載體連接，篩選的陽性重組克隆質(zhì)粒pMD18-T-OMP2 經(jīng)BamHI和SalⅠ雙酶切鑒定后可見與預(yù)期大小相符的條帶（圖2）。

圖2 重組質(zhì)粒pMD18-T-OMP2 雙酶切鑒定結(jié)果

2.3 副豬嗜血桿菌OMP2 基因的核苷酸序列分析

經(jīng)序列測定分析表明，擴(kuò)增出的基因片段全長為1092 bp，編碼363個(gè)氨基酸，與GenBank 所登錄的副豬嗜血桿菌SH0165 株基因組(登錄號：NC_011852)對應(yīng)的OMP2 基因核苷酸序列同源性99.8%，其中本實(shí)驗(yàn)測序的副豬嗜血桿菌OMP2 基因在175 位和177 位發(fā)生了堿基突變，分別由T →C和A →G，但編碼的氨基酸序列并未發(fā)生變化，同源性為100%。

2.4 副豬嗜血桿菌OMP2 外膜蛋白分子特征

應(yīng) 用DNAMAN 和ExPASy 服務(wù)器上的ProtParam 軟件（http://web.expasy.org/protparam/） 對副豬嗜血桿菌OMP2 基因編碼的外膜蛋白P2 分子特征進(jìn)行分析，推導(dǎo)出的外膜蛋白P2 原子總數(shù)為5463，分子式C1733H2700N482O546S2，分子質(zhì)量為39087.45 Daltons（道爾頓），含有47個(gè)強(qiáng)堿性氨基酸（K、R)、38 個(gè)強(qiáng)酸性氨基酸(D、E)、114 個(gè)疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)、106 個(gè)極性氨基酸(N，C，Q，S，T，Y)；等電點(diǎn)pI 為9.21；半衰期為30h（體外哺乳類網(wǎng)狀細(xì)胞）、大于20h（酵母體內(nèi)）、大于10h（大腸桿菌體內(nèi)）；不穩(wěn)定系數(shù)為16.73，推測OMP2 外膜蛋白為穩(wěn)定性蛋白；脂肪指數(shù)為70.63，總體平均親水性為-0.494。

2.5 副豬嗜血桿菌OMP2 外膜蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

應(yīng)用DNAStar中的Karplus-Schulz 方法預(yù)測OMP2 外膜蛋白的柔性 區(qū) 域，Garnier-Robson 和Chou-Fasman 方法預(yù)測OMP2 外膜蛋白的α-螺旋、β-折疊、β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲（圖3）。結(jié)果可見OMP2 外膜蛋白的柔性區(qū)域位于24～35，41～65，4～76，83～97，99～105，120～121，127～132，135，141～146，149～156，161～166，173～177，188～204，216～221，230～240，243～248，266～268，273～281，286～287，293～298，305～311，329，336～352區(qū)段，呈現(xiàn)出散在分布。

2.6 副豬嗜血桿菌OMP2 外膜蛋白的抗原表位預(yù)測

應(yīng) 用DNAStar 中 的Kyte-Doolittle 方法預(yù)測OMP2 外膜蛋白的親水區(qū)，Jameson-wolf 方法預(yù)測OMP2外膜蛋白的抗原指數(shù)，Emini 原則預(yù)測OMP2 外膜蛋白可能的抗原表位，綜合以上各種預(yù)測方法表明OMP2 外膜蛋白可能的抗原表位區(qū)為N 端第23～35 位、42～63 位、73～105 位、147～157位、229～249 位、186～201 位、304～313 位、340～351 位（圖4）。

圖 3 根據(jù)2 種不同的方法預(yù)測副豬嗜血桿菌OMP2 外膜蛋白的二級結(jié)構(gòu)

圖4 OMP2 外膜蛋白親水性位點(diǎn)、抗原指數(shù)和表面可能位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果

2.7 副豬嗜血桿菌OMP2 的信號肽和跨膜區(qū)預(yù)測

利用SignalP 軟件 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 對HPS OMP2 基因編碼的蛋白序列進(jìn)行信號肽預(yù)測，利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(NN)和隱馬爾可夫模型(HMM)兩種方法進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果顯示，副豬嗜血桿菌OMP2 外膜蛋白序列最前端的19個(gè)N-末端氨基酸殘基為信號肽序列，最佳切割位點(diǎn)在19～20 個(gè)氨基酸，機(jī)率為0.933，且信號肽區(qū)域主要為疏水性氨基酸（圖5 和圖6）；而生 物 學(xué) 軟 件TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測結(jié)果表明，OMP2 外膜蛋白無跨膜區(qū)。

圖5 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法(NN)預(yù)測OMP2 外膜蛋白信號肽（Signal P）結(jié)果

圖6 隱馬爾可夫模型(HMM)預(yù)測OMP2外膜蛋白信號肽（Signal P）結(jié)果

2.8 副豬嗜血桿菌OMP2 外膜蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過PredictProtein 軟件（https://www.predictprotein.org/） 預(yù) 測，OMP2 外膜蛋白可能含有4 個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、1 個(gè)cAMP 和cGMP 依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、8 個(gè)蛋白激酶C 磷酸化位點(diǎn)、7 個(gè)酪蛋白激酶II 磷酸化位點(diǎn)、1 個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、9 個(gè)N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)。

3 討論

副豬嗜血桿菌是豬呼吸道的一種常在菌，在豬群受到應(yīng)激或者感染其他疾病的情況下容易導(dǎo)致該病的流行。隨著規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的不斷發(fā)展，HPS 與其他細(xì)菌或病毒混合感染的趨勢也日益嚴(yán)重，所以建立一種特異和快速的用于檢測HPS 的診斷方法以及研制預(yù)防HPS 新型高效安全的疫苗具有重要的意義。本研究運(yùn)用PCR 技術(shù)成功地?cái)U(kuò)增了HPS 的OMP2 基因，序列測定表明該基因全長1092bp，編碼363 個(gè)氨基酸，與GenBank 所登錄的副豬嗜血桿菌SH0165 株對應(yīng)核苷酸序列同源性為99.8%，氨基酸序列同源性為100%；該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為16.73，推測其為穩(wěn)定性蛋白；對OMP2 基因編碼的OMP2外膜蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，結(jié)果顯示OMP2 基因含有α-螺旋、β-折疊、β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，柔性區(qū)域呈散在分布，而且具有較多的親水性區(qū)域，是一種親水性蛋白；信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，OMP2 外膜蛋白序列最前端的19 個(gè)N-末端氨基酸殘基為信號肽序列，最佳切割位點(diǎn)在19～20 個(gè)氨基酸，機(jī)率為0.933，且信號肽區(qū)域主要為疏水性氨基酸，由于疏水區(qū)的存在不利于蛋白的表達(dá)，所以去掉信號肽序列有利于外膜蛋白的表達(dá)；跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果表明，OMP2 外膜蛋白無跨膜區(qū)，提示該蛋白可能實(shí)現(xiàn)較高量及可溶性的表達(dá)；對OMP2 外膜蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，該蛋白可能含有4 個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、1 個(gè)cAMP 和cGMP 依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、8 個(gè)蛋白激酶C 磷酸化位點(diǎn)、7個(gè)酪蛋白激酶II 磷酸化位點(diǎn)、1 個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、9 個(gè)N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)。以上分析結(jié)果表明，OMP2 基因編碼的OMP2 外膜蛋白是一種具有前導(dǎo)信號肽的分泌型蛋白，而且推測出的多個(gè)修飾性位點(diǎn)可能對其前體蛋白的加工或生物功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。

近年來的研究表明，革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜蛋白在細(xì)菌的致病過程中起著十分重要的作用。由HPS 的OMP2 基因編碼的OMP2 外膜蛋白，是HPS 一種重要的毒力因子，也是一種具有免疫顯性的膜孔蛋白，作為一種膜孔蛋白，OMP2 外膜蛋白在由煙酰胺衍生的核苷酸底物的一般擴(kuò)散和特定運(yùn)輸均起到一定的功能，而且對不同血清型的副豬嗜血桿菌株都具有相當(dāng)程度的抗原異質(zhì)性，所以可以預(yù)測如果用OMP2 基因的表達(dá)產(chǎn)物建立的ELISA 診斷方法應(yīng)該可以檢測HPS 所有的血清型，李淼等[8]建立了基于重組HPS OMP2 外膜蛋白的檢測檢測HPS 抗體的間接ELISA方法，結(jié)果該方法對于國內(nèi)外廣泛流行的 4，5，12，13 四種血清型HPS 均具有交叉反應(yīng)，而對其他幾種常見的豬病毒和細(xì)菌病原均為陰性反應(yīng)，表明該方法具有良好地特異性。在副豬嗜血桿菌病的診斷中，目前雖然已有用全菌裂解抗原或莢膜多糖抗原建立的ELISA 檢測方法的報(bào)道，但其特異性不強(qiáng)[9-10]。此外，對流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）OMP2 外膜蛋白的研究表明，OMP2 外膜蛋白在HPS 定植以及與人黏蛋白特定組分結(jié)合的過程中可能發(fā)揮一定的作用，而且OMP2 外膜蛋白在通過煙酰胺衍生的核苷酸底物定植在人的呼吸道上是相對穩(wěn)定的。因此，OMP2 外膜蛋白被認(rèn)為是一種潛在的疫苗候選株。本實(shí)驗(yàn)通過對副豬嗜血桿菌OMP2 基因的擴(kuò)增、克隆以及生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步深入研究OMP2 基因提供了理論基礎(chǔ)。

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