張 曼,張麗萍,武 麗,顧志敏
抑郁癥是一種常見的心境障礙綜合征,煩躁、緊張不安的精神狀態(tài),以及憂郁、悲傷的情感狀態(tài)是其主要臨床表現(xiàn)[1]。研究表明,孤養(yǎng)結(jié)合慢性不可預(yù)知性應(yīng)激模型能較好模擬抑郁癥精神及情感狀態(tài)[2],被認(rèn)為是目前與人類抑郁狀態(tài)最為吻合的模型,已廣泛應(yīng)用于抑郁癥發(fā)病機(jī)制及抗抑郁藥物的藥理學(xué)研究[3,4]。
N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受體阻斷劑及其相關(guān)藥物已被證實(shí)具有抗抑郁作用[5]。研究表明,應(yīng)激使大鼠海馬NMDA受體(NMDA-NR1)過度激活從而造成興奮性神經(jīng)毒性作用,導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡,從而引發(fā)抑郁癥[6-8]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中通過終期效應(yīng)觀察證實(shí),加味溫膽湯具有較好的抗抑郁功效,其機(jī)制與調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元凋亡有關(guān)[9]。加味溫膽湯的抗抑郁機(jī)制可能與抑制NMDA受體,阻抑神經(jīng)元凋亡有關(guān)。本研究以孤養(yǎng)結(jié)合慢性應(yīng)激抑郁模型為研究對(duì)象,在抑郁形成的不同階段動(dòng)態(tài)研究加味溫膽湯對(duì)抑郁模型大鼠海馬NMDA-NR1mRNA/蛋白表達(dá)的阻抑作用。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 8周齡SD雄性大鼠128只,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(湘)2009-0004,體質(zhì)量180g±20g,清潔級(jí),由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。按照隨機(jī)數(shù)字表分組法,將大鼠隨機(jī)分成空白組、模型組、中藥組、西藥組,每組32只。中藥組予加味溫膽湯12g/(kg·d)灌胃,西藥組予氟西汀1.8mg/(kg·d)灌胃,模型組、空白組予生理鹽水2mL/(kg·d)灌胃,每日08:00開始,持續(xù)28d。各組在實(shí)驗(yàn)1d即開始行相應(yīng)干預(yù)方法處理。
1.2 實(shí)驗(yàn)材料 RNA prep pure動(dòng)物組織RNA提取試劑盒(離心柱型),天根生化科技(北京)有限公司;Prime Script TMRT Reangent Kit(Perfect Real Time)TaKaRa;SYBR RPremix Ex TaqTM(Perfect Real Time)TaKaRa;Western及IP細(xì)胞裂解液,碧云天公司;考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒,南京建成生物工程研究所;一抗兔抗人NMDA-NR1蛋白多克隆抗體,Saierbio公司;二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG,中杉金橋生物有限公司;轉(zhuǎn)印用PVDF膜,美國Bio-rad公司。
1.3 孤養(yǎng)結(jié)合慢性應(yīng)激抑郁模型[10]大鼠均單籠飼養(yǎng),采用24h禁食,通宵照明,4℃冷水游泳5min,45℃烘箱熱烘5 min,夾尾1min,高速水平振蕩3min,100伏電擊足底1min,懸尾1min,共9種刺激方法,隨機(jī)安排到21d內(nèi),每日一種,每種刺激至少出現(xiàn)2次,同種刺激不能連續(xù)出現(xiàn),使動(dòng)物不能預(yù)料刺激的發(fā)生。
1.4 檢測指標(biāo)與方法 在實(shí)驗(yàn)7d,14d,21d,28d從每組中隨機(jī)選擇8只大鼠,行曠場行為檢測,然后斷頭取腦,分別進(jìn)行QRT-PCR檢測機(jī)Western Blot檢測。
1.4.1 曠場行為(open-field) 以動(dòng)物穿越曠場試驗(yàn)箱底面方塊數(shù)為水平活動(dòng)得分(四爪均進(jìn)入方格方可計(jì)分);以直立次數(shù)為垂直活動(dòng)得分(兩前爪騰空或攀附墻壁方可計(jì)分)。分別在7d,14d,21d,28d測定,每次3min。
1.4.2 QRT-PCR檢測 設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增的cDNA的引物。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成,引物序列分別為:CREB1-f:5’-GCC TCT GGT GAT GTA CAA ACA TAC C-3’;CREB1-r:5’-GGG AGG ACG CCA TAA CAA CTC-3’,引物片段長度82bp;為準(zhǔn)確檢測表達(dá)水平,同時(shí)選用內(nèi)參引物:beta-actin-f:5’-AGA GGG AAA TCG TGC GTG AC-3’;beta-actin-r:5’-CGA TAG TGA TGA CCT GAC CGT-3’,引物片段長度為137bp。
提取海馬組織總RNA,采用紫外分光光度計(jì)檢測OD26O/OD280比值。
進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
1.4.3 Western-Blot檢測 按照試劑盒要求提取海馬組織,根據(jù)樣品OD值調(diào)整蛋白濃度。NMDA-NR1蛋白相對(duì)表達(dá)量以相應(yīng)蛋白/beta-actin灰度值表示。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。
2.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)描述 在實(shí)驗(yàn)24d時(shí),中藥組1只大鼠因灌胃損傷死亡,此鼠數(shù)據(jù)不納入統(tǒng)計(jì)。共127只大鼠進(jìn)入結(jié)果分析。
2.2 open-field檢測 在抑郁形成過程中,模型組open-field實(shí)驗(yàn)水平、垂直運(yùn)動(dòng)得分均呈上升趨勢(shì),21d、28d時(shí),兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);經(jīng)治療后,抑郁大鼠水平運(yùn)動(dòng)及垂直運(yùn)動(dòng)得分得到上調(diào),21d、28d時(shí)中、西藥組水平運(yùn)動(dòng)及垂直運(yùn)動(dòng)得分高于模型組(P<0.05或P<0.01)。詳見表1、表2。
表1 各組大鼠在抑郁形成不同時(shí)間段水平運(yùn)動(dòng)得分比較(x±s) 分
表2 各組大鼠在抑郁形成不同時(shí)間段垂直運(yùn)動(dòng)得分比較(x±s) 分
2.3 海馬NMDA-NR1mRNA表達(dá)檢測 21d時(shí)與空白組比較,模型組大鼠海馬NMDA-NR1mRNA表達(dá)增加(P<0.01);與模型組比較,中、西藥組NMDA-NR1mRNA表達(dá)減少(P<0.05)。28d時(shí)與空白組比較,模型組NMDA-NR1 mRNA表達(dá)增加(P<0.01);與模型組比較,中、西藥組NMDANR1mRNA減少(P<0.05)。詳見表3。
表3 不同時(shí)間段各組大鼠NMDA-NR1mRNA相對(duì)表達(dá)量(x±s) %
2.4 海馬NMDA-NR1蛋白表達(dá)檢測 21d時(shí)與空白組比較,模型組NMDA-NR1蛋白表達(dá)增加(P<0.01);與模型組比較,中、西藥組NMDA-NR1蛋白表達(dá)減少(P<0.05)。28d時(shí)與空白組比較,模型組NMDA-NR1蛋白表達(dá)增加(P<0.01);與模型組比較,中、西藥組NMDA-NR1蛋白減少(P<0.01)。詳表4。
表4 各組大鼠在抑郁不同時(shí)間段NMDA-NR1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(x±s) %
曠場實(shí)驗(yàn)中的水平運(yùn)動(dòng)得分反映動(dòng)物活動(dòng)度情況,垂直運(yùn)動(dòng)評(píng)分反映動(dòng)物對(duì)新鮮環(huán)境的好奇程度,抑郁模型大鼠曠場實(shí)驗(yàn)的水平運(yùn)動(dòng)評(píng)分及垂直運(yùn)動(dòng)評(píng)分均低于正常大鼠[11]。本實(shí)驗(yàn)觀察到,抑郁模型大鼠在實(shí)驗(yàn)21d、28d出現(xiàn)以上相似變化,加味溫膽湯對(duì)此變化具有拮抗作用,21d,28d時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。由此推斷,加味溫膽湯對(duì)抑郁模型大鼠具有較好抗抑郁效應(yīng),21d時(shí)顯效,隨著干預(yù)時(shí)間的延長,28d時(shí)效應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)。
在抑郁癥發(fā)病機(jī)制及抗抑郁治療中,NMDA受體的作用已受到關(guān)注。目前已知,NMDA受體廣泛存在于中樞、海馬、紋狀體等部位,具有調(diào)節(jié)Ca2+門控通道,引起細(xì)胞毒性作用。在應(yīng)激刺激時(shí),谷氨酸(Glu)所產(chǎn)生的遲發(fā)性損傷主要由NMDA受體介導(dǎo),Glu不斷增加,過度激活的NMDA受體,使配體門控性Ca2+通道病理性開放,引起大量胞外Ca2+內(nèi)流,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載。胞外鈣大量內(nèi)流引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載是細(xì)胞死亡的重要原因,是多種因素引起神經(jīng)細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)損害直至死亡的“最后共同通路”。胞漿內(nèi)游離鈣濃度升高的直接后果是激活在正常條件下受鈣調(diào)控的各種酶系統(tǒng),包括蛋白酶、氧化酶系、蛋白激酶、磷脂酶、核酸內(nèi)切酶等,其結(jié)果不但進(jìn)一步加重生物膜的損害及能量危機(jī),而且與自由基的產(chǎn)生及其損傷作用密切相關(guān)。越來越多的臨床研究證實(shí),NMDA-NR1在抑郁癥的病理生理機(jī)制及抗抑郁藥治療中起著重要作用,臨床中發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者腦中NMDA-NR1表達(dá)升高[12]。在抑郁動(dòng)物模型中,NMDA-NR1拮抗劑已被證實(shí)具有抗抑郁作用[13,14]。
本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),模型組NMDA-NR1mRNA及蛋白表達(dá)在抑郁形成過程中呈上升趨勢(shì),21d時(shí)模型組NMDA-NR1mRNA及蛋白表達(dá)高于空白組(P<0.01),28d時(shí)差異增大(P<0.01)。由于在生物體內(nèi)NMDA-NR1興奮性由其數(shù)量及活性所決定,從而提示抑郁模型大鼠海馬NMDA-NR1處于興奮狀態(tài)。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn),加味溫膽湯的抗抑郁效應(yīng)隨著干預(yù)時(shí)間的延長,至28d時(shí)明顯增強(qiáng)。加味溫膽湯可能通過阻抑NMDA-NR1興奮性發(fā)揮其抗抑郁效應(yīng)。結(jié)合前期加味溫膽湯對(duì)抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡阻抑作用的研究結(jié)果[9],認(rèn)為加味溫膽湯抗抑郁效應(yīng)的藥理機(jī)制可能與阻抑海馬NMDA-NR1興奮性,減少神經(jīng)元凋亡有關(guān)。
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