王少帥，李常新，尤洪嶺，王艷艷

神經前體細胞（neural precursor cells，NPCs）具有自我更新和增殖為神經元和膠質細胞的能力。腦梗死后NPCs可移行至缺血灶周圍，補充、修復神經元的缺失和功能損傷，發(fā)揮內源性抗損傷修復作用[1]。本研究旨在動態(tài)觀察急性腦梗死及電針治療后梗死灶邊緣Brdu陽性細胞數和DCX陽性細胞數，探討腦梗死后電針治療對NPCs移行在中樞神經損傷修復中的作用。為卒中后神經功能恢復提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 動物來源及模型制備 選用2月～3月齡雄性SD大鼠（山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供）60只，體重80g～120g，應用雙腎雙夾法復制易卒中型腎性高血壓大鼠（RHRSP）模型。用大鼠心率血壓計經尾部測血壓，腎動脈狹窄前測量1次，狹窄后每周1次。造模后16周取血壓≥180mmHg且無腦卒中癥狀，體重450g～500g的RHRSP大鼠，參照 Wahl等[2]的方法電凝MCA跨嗅束后的主干，并于顯微鏡下見MCA供血中斷，制成凝閉大腦中動脈（MCAO）模型。

1.2 神經功能評分 依照Garcia等[3]的18分綜合評分法。MCAO后12h始每日（1周后改為2次／周）由2人同時評分，其中1人不知觀察鼠屬于何組。

1.3 動物分組 采取隨機分組。對照組：RHRSP非MCAO（只作相同的開顱術，但不凝閉大腦中動脈）1周、2周、3周、4周，每周組3只，共12只；腦梗死組：RHRSP與 MCAO模型成功1周、2周、3周、4周，每周組6只，共24只；電針組：RHRSP與MCAO模型成功行電針治療1周、2周、3周、4周，每周組6只，共24只。

1.4 方法

1.4.1 Brdu標記 使用細胞增殖特異性標記物Brdu，以10 mg／mL溶于生理鹽水。各組于MCAO后24h始腹腔注射Brdu（50mg／kg）標記處于增殖狀態(tài)的NPCs。在注射日共注射3次，間隔8h。分組及在MCAO后注射時間為：1周組第6天；2周組第6、13天；3周組第6、13、20天；4周組第6、13、20、27天，各組最后一次注射后12h處死取腦。

1.4.2 電針治療 選穴穴位參考《實驗針灸學》[4]中常用實驗動物的針灸穴位而確定，針刺方法參考孟競壁等[5]操作方法，MCAO后24h，用30號1寸毫針刺入病灶對側，相當于人的手三里、外關、伏兔及足三里，進針深度2mm～3mm。針柄接至CMNS6－1型電子針灸治療儀行電刺激，1次／日。頻率2Hz連續(xù)波，輸出強度3，20min／次。6d一療程，停一天進行下一療程。腦梗死組只做相同捆綁而不針刺。

1.4.3 病理學檢查 經常規(guī)灌注后取腦，固定，脫水，石蠟包埋，由前向后作冠狀切片，片厚5μm，取經梗死灶周腦組織。行常規(guī)HE染色，觀察梗死灶周組織病變情況。梗死灶的計算：HE染色切片用Leica Q570圖像分析檢測。計算每張冠狀切片上梗死灶的面積，每個組織塊梗死灶體積按下列公式計算：V＝t1（A 1＋A 2）／2＋t 2（A 2＋A 3）／2＋…＋t n－1（An－1＋A n）／2（注：V為體積，t為兩相鄰冠狀面的間距，A為每一冠狀面上梗死灶面積，n為冠狀面序列號）。

1.4.4 免疫熒光染色 分別檢測各組不同時間點梗死灶周相同部位Brdu陽性細胞及DCX陽性細胞數。操作嚴格按照試劑盒說明進行，烤片，脫蠟，抗原修復，血清封閉，滴加熒光標記二抗，每張切片在灶周相同部位隨機觀察3個視野，400倍熒光顯微鏡下計數Brdu陽性細胞及DCX陽性細胞數。

2 結 果

2.1 模型制作結果 RHRSP術前血壓為110.08mmHg±11.91 mmHg，術后16周平均血壓為198.37mmHg±21.45mmHg。

2.2 神經功能評分 對照組評分18分（正常）。MCAO后評分隨時間逐漸增高，5d時恢復正常，電針后2d與3d大鼠行為學評分較梗死組高（與腦梗死組比較，經t檢驗，P＜0.05）。

2.3 不同時間點各組腦組織病理變化情況 HE染色可見對照組神經元分布均勻，間隙正常，細胞核圓形藍染。MCAO后1周梗死灶內腦組織軟化，細胞腫脹、胞漿液化，細胞及小血管周圍的間隙加寬。2周時上述區(qū)域為軟化灶，灶內有炎性細胞浸潤。3周、4周后病灶萎縮、深陷，灶內、灶周有疤痕形成，梗死后4周內隨著時間延長梗死體積漸縮小。電針治療后前3周梗死體積較腦梗死組縮小（P＜0.05），4周時無顯著差別。腦梗死灶大小比較見表1。

表1 大鼠腦內各時間點不同處理組腦梗死灶大小比較（±s） %

表1 大鼠腦內各時間點不同處理組腦梗死灶大小比較（±s） %

組別 1周 2周 3周 4周腦梗死組 19.26±5.81 16.32±4.39 14.33±3.51 10.62±4.21電針組 16.35±5.441） 13.61±3.201） 12.54±4.121） 9.81±3.11與梗死組比較，經t檢驗，1）P＜0.05

2.4 不同處理組Brdu陽性和DCX陽性細胞數目 對照組Brdu陽性細胞數目很少，排列稀疏。腦梗死及電針治療后梗死灶邊緣Brdu陽性細胞數目較對照組均增多（P＜0.05），且電針組多于腦梗死組（P＜0.05），隨時間逐漸減少。腦梗死后腦內DCX陽性細胞數目增加，缺血1周時細胞數增加達高峰，之后逐漸減低；電針治療1周末細胞數目明顯增加，2周～4周隨時間延長數目較腦梗死組明顯減少。DCX陽性細胞突起長，有時連在一起似鏈狀；有的細胞突起對稱向各不同方向伸展。各組Brdu陽性和DCX陽性細胞數目詳情見表2。

表2 大鼠腦內不同處理組Brdu陽性和DCX陽性細胞計數（±s） 個／400倍視野

表2 大鼠腦內不同處理組Brdu陽性和DCX陽性細胞計數（±s） 個／400倍視野

組別 1周Brdu＋ DCX＋2周Brdu＋ DCX＋3周Brdu＋ DCX＋4周Brdu＋ DCX＋對照組 1.20±0.65 10.04±3.25 3.05±1.47 7.44±1.95 1.65±1.02 9.19±3.03 2.29±1.25 7.68±2.08腦梗死組 57.50±11.041） 54.01±12.661） 83.80±10.811） 45.91±9.781） 53.45±9.29 34.92±7.551） 31.08±8.201） 24.38±5.501）電針組 78.61±13.881）2）62.22±16.731）2）97.15±15.911）2） 40.18±10.371）2） 69.69±12.011）2）29.50±6.491）2）32.36±9.191）16.91±4.671）2）與對照組比較，經t檢驗，1）P＜0.05；與梗死組比較，經t檢驗，2）P＜0.05

3 討 論

在正常成年哺乳動物腦內，NPCs主要存在于腦室區(qū)和腦室下區(qū)（SVZ）、連接側腦室和嗅球的區(qū)域以及海馬齒狀回。生理狀態(tài)下，NPCs有固定的遷移途徑，經吻側遷移流（RMS）遷移到嗅球分化成顆粒及球旁神經元。腦梗死后NPCs自SVZ呈鏈狀穿過胼胝體、紋狀體邊緣到達缺血區(qū)，發(fā)揮它們修復損傷的作用[6]。

Brdu為細胞增殖的標記物，在中樞神經系統可作為增殖的NPCs的標記物。Doublecortin（DCX）是神經細胞的重要微管相關蛋白，在移行的神經元祖細胞有很強的表達，可作為移行細胞標志物。Zhang等[7]在MCAO后7d處死大鼠，發(fā)現缺血灶周出現大量DCX陽性細胞。在腦缺血后，腦損傷后的微環(huán)境使NPCs發(fā)生遷移。應用時間延遲拍攝顯微鏡發(fā)現DCX陽性細胞由SVZ多個方向移行至缺血灶周圍，DCX可能作為一種內在蛋白來調節(jié)NPCs移行至缺血灶周圍。本研究也證實，MCAO后灶周DCX陽性細胞數目明顯增加，在1周末最多，之后逐漸減低。說明缺血可作為內源性因素誘導新生NPCs增殖并向梗死灶周圍移行，而缺血急性期為移行高峰期。Li等[8]觀察大鼠腦梗死后14d和30d行外周胡須刺激，發(fā)現DCX陽性細胞由SVZ移行至缺血灶周，外周刺激組細胞數明顯多于梗死組；外周刺激組梗死灶周圍Brdu＋／NeuN＋細胞數明顯多于梗死組，提示外周刺激能夠促進神經細胞移行，同時也發(fā)現外周刺激顯著增加血管內皮生長因子（VEGF）和基質衍生因子－1（SDF－1）在缺血灶周的表達。最近大量研究表明[9，10]，VEGF 和SDF－1在NPCs移行過程中發(fā)揮重要作用。

電針有改善神經功能缺損、保護腦缺血后神經元等作用。本實驗結果顯示，電針治療后3周內，梗死灶體積較腦梗死組明顯減小，行為學評分明顯低于腦梗死組，說明電針可減小腦梗死體積，促進神經功能恢復。MACO后各時間段電針組灶周Brdu陽性細胞數明顯多于腦梗死組；DCX陽性細胞數1周末明顯增加，2周～4周隨時間延長數目較腦梗死組明顯減少。證實電針能促進腦梗死后內源性NPCs增殖和向梗死灶周移行，且在梗死后一周效果最明顯。提示電針可能在急性期通過改變腦內微環(huán)境，影響VEGF、SDF－1等細胞因子來促使NPCs向灶周移行，形成對病灶進行修復的物質基礎。而隨著電針治療時間的延長，病灶逐漸恢復，推測可能影響移行的因子逐漸減少致使電針作用減弱。但電針與影響NPCs移行各因素的關系及具體作用機制，還有待于進一步的深入研究。

[1]Zhang RL，Zhang ZG，ZhangL，etal.Proliferation and differentiation of progenitor cells in the cortex and the subventricular zone in the adult rat after focal cerebral ischemia[J].Neuroscience，2001，105（1）：33.

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[3]Garcia JH，Wagner S，Liu KF，etal.Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery oc－clusion in rats[J].Stroke，1995，26：627－635.

[4]鄧春雷.實驗針灸學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1998：7.

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[6]Luzzati F，De Marchis S，Parlato R，et al.New striatal neurons in a mouse model of progressive striatal degeneration are generated in both the subventricular zone and the striatal parenchyma[J].Plos One，2011，6（9）：e25088.

[7]Zhang RL，Chopp M，Gregg SR，et al.Patterns and dynamics of subventricular zone neuroblast migration in the ischemic striatum of the adult mouse[J].Cereb Blood Flow Metab，2009，29（7）：1240－1250.

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