宋海彬，高 振，申曉彧

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊由穩(wěn)定轉(zhuǎn)為不穩(wěn)定，繼而破裂導(dǎo)致血栓形成，是急性冠脈綜合征（ACS）最主要的發(fā)病機(jī)制［1］。基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）是 MMPs家族中的重要成員，是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）代謝的關(guān)鍵酶之一，在動(dòng)脈粥樣斑塊處的血管重構(gòu)、斑塊的不穩(wěn)定及破裂誘發(fā)的ACS中都起著十分重要的作用［2］。

氨氯地平（Amlodipine）是廣泛用于臨床的第三代新型長(zhǎng)效二氫吡啶類(lèi)鈣通道阻滯劑（calcium channel blockers，CCB），臨床上主要應(yīng)用于高血壓治療的一線用藥。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 健康成人靜脈血液來(lái)自山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)院體檢中心；人淋巴細(xì)胞分離液（Lymphocytes Separation Medium1077）為上海華精生物高科技有限公司產(chǎn)品；RPMI-1640培養(yǎng)液；胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品；佛波酯購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司；氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）為北京協(xié)生生物科技有限公司產(chǎn)品；FITC-CD14抗體購(gòu)自日本Beckman Coulter公司。RNA提取試劑盒（TransZol）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司；逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶聯(lián)反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司；引物序列由上海生工生物有限公司合成；酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D公司；氨氯地平為輝瑞公司饋贈(zèng)。

1.2 巨噬細(xì)胞分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)和鑒定 取肝素抗凝靜脈血30 mL分裝到10個(gè)離心管，用RPMI-1640液稀釋1倍并充分混勻，分別緩慢加入等比例淋巴細(xì)胞分離液于離心管中，2 000 r／min離心20min后，吸取中間環(huán)狀云霧狀淋巴細(xì)胞層，再以3 mLPBS液充分混勻，1 500r／min離心洗滌2次；用含10%胎牛血清的RPMI-1640各5mL將細(xì)胞吹開(kāi)混勻，取細(xì)胞懸液至培養(yǎng)瓶，每瓶4mL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，培養(yǎng)至4代后于細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化時(shí)，以40 ng／mL的PAM無(wú)胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h～72 h，待細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞后以RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌3次，置于10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)48h。臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞存活率。用特異性熒光素標(biāo)記的CD14細(xì)胞表面抗體行流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞鑒定。

1.3 試驗(yàn)分組 試驗(yàn)共分5個(gè)組?？瞻讓?duì)照組，不進(jìn)行任何干預(yù)，僅單獨(dú)培養(yǎng)單核巨噬細(xì)胞24h；ox-LDL對(duì)照組，只加入ox-LDL 100mg／mL孵育24h；試驗(yàn)三組分別加入100mg／mL ox-LDL孵育2h后，再分別加入氨氯地平低劑量0.1μmol／L；中劑量1.0μmol／L；高劑量10.0μmol／L培養(yǎng)24h。

1.4 半定量RT-PCR檢測(cè)MMP-9mRNA的表達(dá)水平

1.4.1 RNA提取 棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，每瓶加入1.0mL Trizol，依次加入氯仿、異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌后略晾干，溶于25μL DEPC中。核酸紫外分析儀檢測(cè)，根據(jù)260／280比值，所有樣品A260／A280比值1.9～2.0。并根據(jù)260nm的吸光度值對(duì)樣品的總RNA進(jìn)行初步定量，確定樣品中RNA純度和含量。

1.4.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在20μL體系中進(jìn)行：含1μg RNA，20mg／L 的 oligo（dT）引 物，1.0mml／L dNTP，20U Rnase抑制劑，1×Buffer，200UM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。于PCR儀上42℃反應(yīng)1h，72℃滅活10min后保存于-20℃冰箱中。

1.4.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng) MMP-9上游引物序列為：5′-TCCCTGGAGACCTGAGAACC-3′； 下 游 引 物 序 列 為：5′-GGCAAGTCTTCCGAGTAGTTT-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火60s，72℃延伸60s，循環(huán)29次；末次延伸7min，產(chǎn)物長(zhǎng)度為307bp。B-actin上游引物序列：5′-CCTGAGGCACTCTTCCAG-3′，下 游 引 物 序 列：5′-TCACACTTCATGATGGA-3′，產(chǎn)物大小100bp。

1.4.4 凝膠電泳 取PCR產(chǎn)物10μL在瓊脂糖凝膠上電泳，計(jì)算機(jī)凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照，Toptal軟件分析灰度值，以各條帶與β-actin內(nèi)參條帶灰度比值，代表 MMP-9mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法測(cè)定MMP-9蛋白含量 取六孔培養(yǎng)板上清液進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附雙抗夾心法（enzyme linked immuno-sorbent assay，ELISA）測(cè)定，每組重復(fù)6次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用SPSS 13.0建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 ox-LDL誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞MMP-9mRNA表達(dá) 與空白對(duì)照組比較，ox-LDL各組MMP-9mRNA表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；與ox-LDL對(duì)照組比較，不同劑量氨氯地平組MMP-9 mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；ox-LDL誘導(dǎo)后，不同劑量氨氯地平各組之間比較，隨著氨氯地平劑量增加，MMP-9mRNA表達(dá)逐漸降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

2.2 ox-LDL誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá) 與空白對(duì)照組比較，ox-LDL對(duì)照組MMP-9蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；與ox-LDL對(duì)照組比較，不同劑量氨氯地平組MMP-9蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。ox-LDL誘導(dǎo)后的不同劑量氨氯地平組之間比較，隨著氨氯地平劑量增加MMP-9蛋白表達(dá)逐漸降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 各組MMP-9mRNA和蛋白水平（x±s）

3 討 論

心血管疾病病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化，而血栓的形成與炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展過(guò)程中的作用非常重要。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊由穩(wěn)定轉(zhuǎn)為不穩(wěn)定，繼而破裂導(dǎo)致血栓形成，是急性冠脈綜合征最主要的發(fā)病機(jī)制［1］。粥樣硬化斑塊破裂以及血栓介導(dǎo)的急性心肌梗死最重要的決定因素是斑塊的組成成分，單核巨噬細(xì)胞的聚集，以及合成MMPs的增多和／或內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物減少，是造成粥樣斑塊纖維帽厚度和抗損傷強(qiáng)度降低，斑塊穩(wěn)定性下降的重要因素［3］。

基質(zhì)金屬蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)致纖維帽變薄破裂，是急性冠脈綜合征臨床事件發(fā)生的重要原因，MMP-9是其中重要一員［4］。MMP-9由活化的巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等以蛋白酶原前體的形式從細(xì)胞內(nèi)分泌到細(xì)胞外，MMP-9的作用底物有明膠、Ⅳ型和Ⅴ型膠原、蛋白聚糖、彈性蛋白。MMP-9活性增強(qiáng)可導(dǎo)致膠原裂解增加［5］。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊局部，MMPs主要來(lái)源于激活的巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，在人動(dòng)脈粥樣硬化斑塊容易發(fā)生破裂的部位（尤其是斑塊肩部和脂質(zhì)核處），MMP-1、MMP-2、MMP-9和MMP-3活性均有增高［6］。

氧化低密度脂蛋白作為獨(dú)立的危險(xiǎn)因素在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展及急性冠脈綜合征形成中占有重要的地位，在動(dòng)脈粥樣硬化中ox-LDL除了直接導(dǎo)致內(nèi)皮損傷外，還可以引起單核細(xì)胞趨化、巨噬細(xì)胞源泡沫細(xì)胞形成和細(xì)胞毒性產(chǎn)生 ，并且可以調(diào)節(jié)粥樣斑塊內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞和生長(zhǎng)因子的合成［7］。ox-LDL可增加單核細(xì)胞源巨噬細(xì)胞MMP-9的蛋白表達(dá)并增強(qiáng)其活性，是細(xì)胞功能和基因表達(dá)的主要調(diào)節(jié)因子［8］。

氨氯地平可能機(jī)制有抗氧化、抗炎、改善內(nèi)皮功能、抑制血管平滑肌增殖與遷移、保持斑塊穩(wěn)定性等［9］。

本研究用ox-LDL誘導(dǎo)人單核巨噬細(xì)胞24h后，與單核巨噬細(xì)胞組相比，MMP-9mRNA及其蛋白表達(dá)增加，與文獻(xiàn)報(bào)道一致；ox-LDL誘導(dǎo)人單核巨噬細(xì)胞2h后，加入不同劑量的氨氯地平，與ox-LDL空白對(duì)照組相比，MMP-9的表達(dá)減少且與氨氯地平的劑量有濃度劑量依賴關(guān)系。氨氯地平可通過(guò)抑制ox-LDL誘導(dǎo)的人單核巨噬細(xì)胞MMP-9的表達(dá)，發(fā)揮穩(wěn)定粥樣斑塊和抗炎的作用，減少急性冠脈事件的發(fā)生，但其通過(guò)何種途徑減少M(fèi)MP-9的表達(dá)，還有待進(jìn)一步研究。

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