孫宏燕，董聯(lián)玲，崔紅燕，曹 娟

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD），又稱老年性癡呆（Senile dementia），是一種病因未明的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，表現(xiàn)為大腦皮層獲得性高級(jí)功能的全面障礙，包括記憶、語(yǔ)言、感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)等功能的進(jìn)行性受損，并常伴有人格、性格和情感控制等方面的異常。中藥紅景天為景天科（Crassulaceae）紅景天屬（Rhodiola L.）多年生草本或亞灌木植物，具有改善心腦血管系統(tǒng)功能、增強(qiáng)免疫、抗疲勞、耐缺氧、抗衰老等多方面藥理作用，研究表明紅景天有很廣闊的應(yīng)用前景［1］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀測(cè)紅景天對(duì)AD大鼠行為學(xué)及海馬組織突觸后致密蛋白（PSD-95）、shank-1蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步研究紅景天治療AD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物：5月齡健康雄性Wistar大鼠40只，體重（350±20）g，由山西醫(yī)科大學(xué)生理教研室提供。藥品及主要試劑：紅景天顆粒；喜得鎮(zhèn)；AlCl3；D-半乳糖；PSD-95、shank-1免疫組化試劑盒。主要儀器：MT-200Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)；電子天平；低溫冰箱；熒光照相顯微鏡；Olympus照相顯微鏡等。

1.2 試驗(yàn)方法 模型制備：藥物造模組以腹腔注射D-半乳糖50mg／（kg·d）和灌胃 AlCl32mL／d，每日一次，持續(xù)6周。行為學(xué)測(cè)試前10min對(duì)藥物造模組以2mg／kg腹腔注射東莨菪堿制作AD大鼠復(fù)合模型［2］，空白組給予相同劑量的生理鹽水腹腔注射和灌胃。分組及給藥：動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，40只雄性Wistar大鼠經(jīng)水迷宮測(cè)試去掉不符合條件者。將39只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成空白對(duì)照組（9只）和藥物造模組（30只）。造模6周后進(jìn)行水迷宮測(cè)試做出模型評(píng)價(jià)。模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：以空白組大鼠逃避潛伏期的均值為參考值，計(jì)算每只大鼠的平均逃避潛伏期值與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期時(shí)間的比值，該值＞20%則表示造模成功。將造模成功的大鼠（26只）分為模型組（8只）、中藥組（9只）和西藥組（9只）。第7周開(kāi)始同時(shí)給藥干預(yù)：中藥組用紅景天按生藥5g／（kg·d）灌胃，西藥組用喜得鎮(zhèn)以1mg／（kg·d）灌胃，空白對(duì)照組以1 0 mL／（kg·d）蒸餾水灌胃，持續(xù)4周。水迷宮行為學(xué)測(cè)試：參照Morris水迷宮（Morris water maze，MWM）實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定大鼠空間識(shí)別能力（包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間搜索實(shí)驗(yàn)）［3］。

1.3 標(biāo)本制備及指標(biāo)檢測(cè) 水迷宮測(cè)試24h后，采取心臟灌注法處死大鼠，用10%中性緩沖液甲醛固定4h以上，石蠟包埋切片。采用免疫組化法根據(jù)說(shuō)明書(shū)檢測(cè)PSD-95、shank1蛋白含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 水迷宮測(cè)試結(jié)果

2.1.1 定位航行試驗(yàn)（見(jiàn)表1） 隨著訓(xùn)練時(shí)間的推移，訓(xùn)練次數(shù)的增多，各組大鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間縮短。模型組大鼠潛伏期較空白組明顯延長(zhǎng)（P＜0.01），中藥組、西藥組大鼠潛伏期較模型組明顯縮短（P＜0.01），而中藥組與西藥組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠在定位航行實(shí)驗(yàn)中的平均逃避潛伏期（x±s）s

2.1.2 空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（見(jiàn)表2） 與模型組相比，其他各組目的象限停留時(shí)間、有效區(qū)停留時(shí)間、平臺(tái)停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P＜0．01），中藥組與西藥組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（x±s） s

2.2 各組大鼠海馬區(qū)免疫組化結(jié)果比較（見(jiàn)表3） 與空白組相比，模型組大鼠PSD-9 5、shank-1蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，中藥組與西藥組PSD-95、shank-1蛋白表達(dá)顯著提高（P＜0.01），中藥組、西藥組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠PSD-95、shank-1免疫組化比較（x±s）

3 討 論

本研究采用復(fù)合型AD大鼠模型，集衰老、鋁中毒、膽堿能損傷為一體，可以更好地模擬出AD患者的病理生理及行為學(xué)表現(xiàn)。紅景天具有益氣活血、通脈平喘等功效，《本草綱目》記載“紅景天，本經(jīng)上品，祛邪惡氣，補(bǔ)諸不足”是“已知補(bǔ)益藥中所罕見(jiàn)”，臨床及實(shí)驗(yàn)研究初步研究表明，紅景天具有抗缺氧、抗疲勞、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等作用，顯示出紅景天對(duì)癡呆治療有廣闊的應(yīng)用前景。本研究采用Morris水迷宮方法檢測(cè)AD大鼠行為學(xué)能力變化，結(jié)果顯示，模型組認(rèn)知能力較空白組明顯下降，經(jīng)治療后，中藥組、西藥組與模型組相比認(rèn)知能力明顯改善，表明紅景天在一定程度上改善了AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能障礙。

學(xué)習(xí)和記憶障礙為AD早期的突出表現(xiàn)，其程度與突觸數(shù)目的丟失及突觸功能的喪失密切相關(guān)［4］。神經(jīng)元的動(dòng)態(tài)特征即突觸可塑性，是學(xué)習(xí)記憶形成的一個(gè)重要形態(tài)學(xué)和功能學(xué)基礎(chǔ)，其主要表現(xiàn)形式是長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)和長(zhǎng)時(shí)程抑制。突觸后致密物質(zhì)（postsynaptic density，PSD）是化學(xué)性突觸的一種超微結(jié)構(gòu)，接受和整合突觸信號(hào)并將其傳導(dǎo)給突觸后細(xì)胞，在突觸可塑性中起重要作用。其中PSD-95是細(xì)胞支架蛋白，能影響突觸及神經(jīng)元的可塑性，神經(jīng)遞質(zhì)以及其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的合成，調(diào)控神經(jīng)元對(duì)神經(jīng)傳導(dǎo)信號(hào)的免疫應(yīng)答，在突觸發(fā)育和再塑中具有重要的作用。目前研究表明，PSD-95參與了學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)過(guò)程，對(duì)學(xué)習(xí)記憶的形成和鞏固有著重要意義［5］。shank是一種表達(dá)在PSD區(qū)域的多結(jié)構(gòu)域的骨架蛋白，在突觸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。多項(xiàng)研究表明，shank-1可將突觸后膜上的3種谷氨酸受體串聯(lián)起來(lái)，結(jié)合于NMDA信號(hào)復(fù)合體中調(diào)節(jié)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)和長(zhǎng)時(shí)程抑制。此外，shank-1蛋白連接了突觸后的谷氨酸、磷酸肌醇、生長(zhǎng)抑素等多型受體、多種蛋白和細(xì)胞骨架。因此，在介導(dǎo)各種受體間的信號(hào)傳導(dǎo)和維持突觸正常功能方面有重要作用［6，7］。本研究結(jié)果提示，模型組PSD-95和shank-1蛋白的表達(dá)明顯下降，經(jīng)治療后中、西藥組PSD-95和shank-1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，表明紅景天可以增加PSD-95和shank-1蛋白表達(dá)。中、西藥組之間比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明紅景天治療AD與喜得鎮(zhèn)等效。

紅景天對(duì)AD大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用可能是通過(guò)上調(diào)PSD-95和shank-1蛋白的表達(dá)，從而影響突觸及神經(jīng)元的可塑性、神經(jīng)遞質(zhì)以及其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的合成、調(diào)控神經(jīng)元對(duì)神經(jīng)傳導(dǎo)信號(hào)的免疫應(yīng)答，進(jìn)而改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，對(duì)AD的防治具有現(xiàn)實(shí)意義，但具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

［1］ 王家明，閏繼平，王盛虔.紅景天的藥理作用進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2003，31（4）：57.

［2］ 宋玉娟，張力，徐會(huì)深，等.電針治療阿爾茨海默病的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2005，33（3），39-40.

［3］ 胡鏡清，溫澤淮，賴世隆，等.Morris水迷宮檢測(cè)的記憶屬性與方法學(xué)初探［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，17（2）：117-120.

［4］ Coleman PD，Yao PJ.Synaptic slaughter in Alzheimer’s disease［J］.Neurobiol Aging，2003，24（8）：1023-1027.

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