張 慧，王 雄，黃宏亮，楊 柳

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）是冠心病實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn)課題。有關(guān)腺苷對心肌缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用已有文獻(xiàn)報道，體現(xiàn)在其舒張冠狀動脈、抑制凋亡、減輕炎性反應(yīng)等方面［1］。而腺苷作用于熱休克蛋白70（heat shock protein，HSP70）進(jìn)而干擾細(xì)胞凋亡程序來發(fā)揮抗心肌缺血再灌注損傷的有關(guān)文獻(xiàn)報道較少。本課題擬建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，闡明腺苷后處理對缺血再灌注損傷后心肌組織HSP70表達(dá)及心肌細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)一步探討腺苷保護(hù)心肌缺血-再灌注損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及試劑 健康清潔級成年雄性Wistar大鼠24只，體重（230±30）g，由山西醫(yī)科大學(xué)生理實(shí)驗(yàn)室提供。腺苷購自美國Sigma公司，生理鹽水按比例溶解稀釋。小鼠抗大鼠HSP70單克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，PCR引物購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 動物模型制備 大鼠術(shù)前12h禁食不禁飲，腹腔注射25%烏拉坦（4mL／kg）麻醉后，氣管插管，微型動物呼吸機(jī)輔助呼吸，針形電極插于四肢皮下記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，開胸暴露心臟，左心耳下緣2cm處，以1.0mm～1.5mm深度進(jìn)針穿線（6-0絲線），套管夾畢法結(jié)扎左冠狀動脈前降支（LAD）。以結(jié)扎后心電圖ST-T抬高，放松后ST-T回落50%為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 動物分組與給藥 24只健康雄性Wistar大鼠按體重從小到大依次編號，用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（Sham組）、缺血再灌注組（I／R組）、腺苷后處理組（AD組），每組8只。Sham組：只穿線不結(jié)扎，麻醉150min；I／R組：結(jié)扎30min，再灌注120min；AD組：結(jié)扎30min，于結(jié)扎25min時股靜脈微量注射泵給藥5min［305μg（kg·min）］，之后再灌注120min。Sham組和I／R組均于前述注射腺苷相同時間點(diǎn)于股靜脈給定量生理鹽水，5min內(nèi)輸注完作為平衡對照。術(shù)中大鼠死亡剔除，再隨機(jī)補(bǔ)充。

1.4 標(biāo)本制備 各組大鼠于實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)迅速剪取心臟，冰生理鹽水沖洗后，剪取左心室缺血區(qū)心肌組織，其中隨機(jī)取各組中兩只大鼠心肌100mg，迅速于-80℃冰箱凍存，余心肌組織置于10%甲醛液中保存48h。固定脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚2μm，60℃烤片備用。每個心肌組織標(biāo)本切片兩份，分別進(jìn)行TUNEL及HSP70免疫組化染色。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡 嚴(yán)格按照試劑盒說明書完成操作，每張切片于250倍光鏡下隨機(jī)計數(shù)5個非重復(fù)視野陽性細(xì)胞數(shù)（胞核呈棕黃色顆粒）及心肌細(xì)胞總數(shù)，計算心肌細(xì)胞凋亡率。

1.5.2 免疫組織化學(xué)染色 切片常規(guī)脫蠟、過氧化氫孵育、高壓抗原修復(fù)，滴加1∶100的HSP70抗體，放入4℃冰箱過夜、滴加生物素標(biāo)記的二抗、再滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素、DAB顯色、脫水、復(fù)染、封片。每張切片于250倍光鏡下隨機(jī)拍取5個非重復(fù)視野，以細(xì)胞漿／核呈棕黃色顆粒視為HSP70蛋白表達(dá)陽性，BI-200圖像分析系統(tǒng)分析平均光密度值。

1.5.3 熒光實(shí)時定量PCR檢測組織microRNA-1表達(dá) 取50 mg心肌組織，Trizol法提取總RNA，紫外吸收測定法檢測RNA純度，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，Realtime PCR儀進(jìn)行PCR檢測，以U6作為內(nèi)參，microRNA-1的 上 游 引 物 是 5′GGGGTGGAATGTAAAGAAG3′，下游引物是5′TGCGTGTCGTGGAGTC3′。內(nèi)參U6的上游引物是5′GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3′，下 游 引 物 是 5′CGCTTCACGAATTTG CGTGTCAT3′，數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進(jìn)行計算。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較行單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)法。

2 結(jié) 果

2.1 TUNEL檢測結(jié)果 Sham組偶見凋亡細(xì)胞；I／R組可見大量凋亡細(xì)胞，呈彌漫性分布；AD組凋亡細(xì)胞率明顯低于I／R組（P＜0.05），但高于Sham組（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 HSP70免疫組化結(jié)果 光鏡下，Sham組存在少量HSP70胞質(zhì)表達(dá)；I／R組HSP70表達(dá)升高，且可見部分胞核表達(dá)；AD組HSP70大量表達(dá)于胞質(zhì)，表達(dá)量顯著升高，且高于I／R組（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組HSP70蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡率比較（x±s）

2.3 心肌組織microRNA-1表達(dá) 與Sham組相比，I／R組microRNA-1表達(dá)水平升高，為原來的4.4 2倍，AD組micro RNA-1表達(dá)水平升高，為原來的2.06倍。與I／R組相比，AD組microRNA-1表達(dá)水平降低，為原來的2.15倍。

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷是冠心病治療的重要課題，如何防治MIRI已成為現(xiàn)今研究的重點(diǎn)內(nèi)容。腺苷作為一種重要的內(nèi)源性活性保護(hù)物質(zhì)，可以通過多種途徑保護(hù)心肌缺血再灌注損傷，如舒張冠狀動脈，減輕再灌注心肌的鈣超載，抑制血小板聚集，減少氧自由基釋放，減輕炎性反應(yīng)，減輕凋亡及減少心肌梗死范圍等。研究發(fā)現(xiàn)［2］，腺苷受體可以觸發(fā)缺血后適應(yīng)，對缺血再灌注產(chǎn)生保護(hù)作用。另有研究發(fā)現(xiàn)［3］，腺苷后處理通過調(diào)節(jié)Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)，從而減輕MIRI引起的心肌細(xì)胞凋亡。

心肌缺血再灌注損傷作用機(jī)制極為復(fù)雜，目前大多認(rèn)為其造成的細(xì)胞損傷形式有兩種，即死亡和凋亡，其中細(xì)胞凋亡占重要地位。1994年，Gottlieb等［4］首先在兔心臟上發(fā)現(xiàn)再灌注損傷促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。目前有關(guān)研究表明細(xì)胞凋亡機(jī)制主要有氧自由基學(xué)說、鈣超載、線粒體損傷等，而信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究多集中在死亡受體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和線粒體途徑。

心肌缺血再灌注損傷后引起了一系列應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)一些特殊基因表達(dá)合成增加，HSP70就是其中之一。目前認(rèn)為HSP70對缺血再灌注損傷的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，HSP70可充當(dāng)分子伴侶的角色，幫助新合成的蛋白質(zhì)正確的折疊、解聚、轉(zhuǎn)運(yùn)，以及結(jié)合受損的蛋白質(zhì)或多肽，使其修復(fù)或通過泛素／蛋白酶體使其降解，從而防止了隨后的細(xì)胞生命信息紊亂，如通過對氧化應(yīng)激誘發(fā)的變性的凋亡抑制蛋白（Bcl-2等）加以修復(fù)或阻止其降解，從而恢復(fù)其凋亡抑制作用。HSP70還可以減輕鈣超載，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，阻礙應(yīng)激誘發(fā)的細(xì)胞凋亡程序來抗缺血再灌注損傷。HSP70可以從多個環(huán)節(jié)阻斷凋亡信號分子而抑制細(xì)胞凋亡，其能阻斷JNK依賴的線粒體途徑［5］，抑制磷酸化抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL［6］，從而抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放，減少細(xì)胞凋亡。HSP70還能通過阻斷位于線粒體的凋亡誘導(dǎo)因子AIF的核移位，而發(fā)揮HSP70的抗凋亡功能［7］。

新近研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-1在促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著重要作用。Yang等［8］研究表明，心肌特異性microRNA-1的表達(dá)水平在缺血心肌中顯著提高。同時Xu等［9］研究發(fā)現(xiàn)，心肌特異性microRNA-1在氧化應(yīng)激大鼠心肌模型中，micro RNA-1抑制了靶蛋白HSP70的表達(dá)，促進(jìn)了心肌細(xì)胞凋亡，但未對HSP70的轉(zhuǎn)錄水平造成影響。另一研究表明［10］，在心肌缺血再灌注模型中心肌特異性microRNA-1的表達(dá)與心肌抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Sham組microRNA-1及HSP70蛋白均有少量表達(dá)，并有少量細(xì)胞凋亡，I／R組microRNA-1及HSP70蛋白表達(dá)增加，并伴有細(xì)胞凋亡的增加，提示microRNA-1及HSP70蛋白參與了心肌缺血再灌注損傷所致細(xì)胞凋亡的過程，這于國內(nèi)外研究報道基本一致。與I／R組相比，AD組心肌組織microRNA-1表達(dá)下調(diào)，HSP70蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，心肌細(xì)胞凋亡明顯減少，說明腺苷后處理可能通過抑制micro RNA-1表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)靶蛋白HSP70表達(dá)，阻斷下游凋亡信號分子而減輕細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到心肌保護(hù)的作用。由于本實(shí)驗(yàn)檢測腺苷后處理對microRNA-1表達(dá)影響的例數(shù)較少，尚需要進(jìn)一步大樣本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了腺苷后處理再灌注心肌的心肌保護(hù)作用，為研究其作用機(jī)制提供了新思路。

［1］ Canyon SJ，Dobson GP.Protection against ventricular arrhythmias and cardiac death using adenosine and lidocaine during regional ischemia in the in vivo rat［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004，287（3）：H1286-H1295.

［2］ Kin H，Zatta AJ，Lofye MT，et al.Postconditioning reduces infarct size via adenosine receptor activation by endogenous adenosine［J］.Cardiovasc Res，2005，67（1）：124-133.

［3］ Zhao ZQ，Budde JM，Morris CD，et al.Adenosine attenuates reperfusion-induced apoptotic cell death by modulating expression of Bcl-2and Bax proteins［J］.J Mol Cell Cardiol，2001，33：57-68.

［4］ Gottlieb RA，Burleson KO，Kloner RA，et al.Reperfusion injury induces apoptosis in rabbit cardiomyocytes［J］.J Clin Invest，1994，94（4）：1621-1628.

［5］ Kumar Y，Tam U.Stress protein flux during recovery form simulated ischemia induced heat shock protein 70confers cytoprotaction by suppressing JNK activation and inhibiting apoptotic cell death［J］.Proteomics，2003，3（4）：513-526.

［6］ Fan M，Goodwin M，Vu T，et al.Vinblastine-induced phosphorylation of Bcl-2and Bcl-XL is mediated by JNK and occurs in parallel with inactivation of the Raf-1／MEK／ERK cascade［J］.J Biol Chem，2000，275（39）：29980-29985.

［7］ Choudhury S，Bae S，Ke Q，et al.Mitochondria to nucleus translocation of AIF in mice lacking Hsp70during ischemia／reperfusion［J］.Basic Res Cardiol，2011，106（3）：397-407.

［8］ Yang B，Lin H，Xiao J，et al.The muscle-specific microRNA miR-1regulates cardiac arrhythmogenic by targeting GJA1and KCNJ2［J］.Nature Medicine，2007，13（4）：486-491.

［9］ Xu C，Lu Y，Pan Z，et al.The muscle-specific microRNAs miR-1 and miR-133produce opposing effects on apoptosis by targeting HSP60，HSP70and caspase-9in cardiomyocytes［J］.J Cell Sci，2007，120（Pt 17）：3045-3052.

［10］ Tang Y，Zheng J，Sun Y，et al.MicroRNA-1regulates cardiomyocyte apoptosis by targeting Bcl-2［J］.Int Heart J，2009，50（3）：377-387.