金鑫，姚良蘋，盧云，李昌生

（1 棗莊礦業(yè)集團中心醫(yī)院普外科，山東 棗莊 277011； 2 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科； 3 濰坊壽光市人民醫(yī)院）

原發(fā)性肝癌（HCC）是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一［1］。多數(shù)病人常伴有不同程度的肝硬化，難以承受手術(shù)切除或經(jīng)動脈化學(xué)栓塞治療，且全身化療毒副作用大。因此，盡管近年來HCC的綜合治療有了很大的進展，但總的說來HCC病人的預(yù)后還是沒有明顯的改善。隨著人們對腫瘤細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究的不斷深入，基因治療已經(jīng)成為21世紀(jì)腫瘤治療的新方法。本實驗采用康萊特作用于人肝癌Hep G2細胞，通過檢測Hep G2細胞抑制率及其凋亡相關(guān)蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－3（Caspase－3）和存活素（Survivin）的表達情況，初步探討康萊特在基因水平誘導(dǎo)Hep G2肝癌細胞凋亡的機制?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料及其來源

Hep G2肝癌細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞庫，為貼壁細胞。RPMI－1640培養(yǎng)基和二甲基亞砜（DMSO）均購自美國GIBCO公司。細胞凋亡檢測試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司。Mouse Ig G1／Ig G1和FITC／PE試劑盒購自北京市晶美基因谷科技有限公司。Caspase－3鼠抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechnol ogy公司。Survivin鼠抗人單克隆抗體購自R＆D Systems Inc。

1.2 Hep G2肝癌細胞的培養(yǎng)

貼壁Hep G2肝癌細胞用含體積分?jǐn)?shù)0.10標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的細胞培養(yǎng)基RPMI－1640培養(yǎng)至對數(shù)生長期，待80%細胞匯合后，加入2.5 g／L的胰蛋白酶液1～2 mL消化，反復(fù)吹打瓶底壁細胞，形成細胞懸液；吸取1／20細胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)并加入適量新鮮培養(yǎng)液；放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測Hep G2細胞抑制率

取對數(shù)生長期細胞移入96孔培養(yǎng)板，細胞密度1×108／L，每孔加細胞懸液200μL。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸棄孔內(nèi)原培養(yǎng)液，加含體積分?jǐn)?shù)0.005、0.010、0.015、0.020康萊特注射液的 RPMI－1640培養(yǎng)液200μL。各藥物分別設(shè)4個平行復(fù)孔，另設(shè)1個空白對照孔。分別培養(yǎng)12、24、48 h，每孔加入5 g／L MTT液20μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，棄上清液，加入DMSO 150μL終止反應(yīng)。采用酶標(biāo)儀于490 n m波長處測定吸光度（A）值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）＝（1－A藥物／A對照）×100%。

1.4 流式細胞儀測定細胞凋亡情況

調(diào)節(jié)細胞密度為1×108／L，并置于6孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24 h后棄上清液，用含體積分?jǐn)?shù)0.005、0.010、0.015、0.020的康萊特體外培養(yǎng) Hep G2細胞，每種濃度設(shè)平行4孔（即每種濃度重復(fù)4次），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞，并設(shè)空白對照。用4℃預(yù)冷的PBS洗細胞2次，用250μL結(jié)合緩沖液重新懸浮細胞，調(diào)節(jié)其密度為1×109／L；取100μL的細胞懸液置于5 mL流式管中，加入Annexin V／FITC 5μL和20 mg／L碘化丙錠溶液10μL；混勻后于室溫避光孵育15 min；在反應(yīng)管中加PBS 400μL，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.5 流式細胞儀檢測Caspase－3和Survivin表達

調(diào)節(jié)細胞密度為1×108／L，并置于6孔培養(yǎng)板中；培養(yǎng)24 h后棄上清液，分別加入含體積分?jǐn)?shù)0.005、0.010、0.015、0.020康萊特注射液的 RPMI－1640培養(yǎng)液200μL，每種濃度設(shè)平行4孔（即每種濃度重復(fù)4次），并設(shè)空白對照；繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集約1010／L細胞到流式管內(nèi)，離心5 min；棄去上清液，PBS重懸細胞，使其密度為1010／L，加入終止液孵育10 min；康萊特組加入Caspase－3和Survivin熒光抗體均為20μL，對照組加入同型對照Mouse Ig G1／Ig G1和FITC／PE 20μL，置于避光的冰盒內(nèi)震蕩孵育30 min；每管加2 mL PBS，2 000 r／min離心10 min，取上清液500μL，以40 g／L多聚甲醛重懸。流式細胞儀檢測Caspase－3和Survivin表達。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

2.1 康萊特對肝癌細胞Hep G2增殖的抑制作用

同一時間下，隨著康萊特劑量升高，其細胞生長抑制率顯著升高，組間比較差異有顯著性（P＜0.01）；同一劑量下，隨著康萊特作用時間延長，其細胞生長抑制率顯著升高，不同時間點比較差異有顯著性（P＜0.01）。見表1。

表1 不同濃度康萊特對肝癌細胞Hep G2抑制率的影響（χ／%，±s）

表1 不同濃度康萊特對肝癌細胞Hep G2抑制率的影響（χ／%，±s）

組別 時間（t／h）12 24 48對 照 組 1.37±0.43 17.05±3.09 18.09±2.06康萊特組0.005 15.85±1.35 24.20±2.84 30.89±1.55 0.010 28.31±1.68 37.12±2.22 49.91±2.03 0.015 37.35±3.11 45.72±1.70 60.78±3.31 0.020 51.12±3.30 58.57±4.56 73.73±5.71

2.2 Hep G2細胞凋亡及Caspase－3、Survivin蛋白的表達

隨著康萊特劑量的增加，其細胞凋亡率逐漸升高（P＜0.01）。體積分?jǐn)?shù)0.005、0.010、0.015、0.020康萊特組Hep G2細胞Caspase－3、Survivin蛋白表達水平與對照組比較，差異均有顯著性（P＜0.01）。見表2。

表2 康萊特誘導(dǎo)Hep G2細胞凋亡及對Caspase－3和Survivin表達的影響（χ／%，±s）

表2 康萊特誘導(dǎo)Hep G2細胞凋亡及對Caspase－3和Survivin表達的影響（χ／%，±s）

組別 細胞凋亡率 Caspase－3 Survivin對 照 組 9.21±0.22 0.48±0.16 13.51±1.20康萊特組0.005 17.98±0.91 1.34±0.21 11.93±0.88 0.010 21.95±1.48 2.58±0.13 9.98±0.67 0.015 23.32±2.72 3.74±0.19 8.89±0.92 0.020 30.32±3.63 4.69±0.24 8.01±0.74

3 討 論

肝細胞性肝癌為最常見的肝臟惡性腫瘤，特別是在東亞地區(qū)尤其明顯［2］。近些年來，人們已經(jīng)逐漸認識到腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅是細胞增殖失控、分化異常的結(jié)果，而且與細胞凋亡失衡有關(guān)［3］。

實驗結(jié)果表明，康萊特的作用主要是阻滯細胞周期G2＋M時相，從而減少細胞有絲分裂，使腫瘤細胞的增殖受到抑制，并可激活某些促細胞凋亡發(fā)生因子，進一步導(dǎo)致細胞凋亡［4］。已有的研究結(jié)果表明，該制劑對多種腫瘤細胞有顯著的抑制作用［5］。本研究結(jié)果也顯示，康萊特不僅能夠有效抑制肝癌細胞增殖，呈現(xiàn)濃度、時間依賴性，而且還能誘導(dǎo)細胞凋亡，促使Caspase－3蛋白表達增加，Survivin蛋白表達減少。

眾所周知，Caspase－3為與細胞凋亡密切相關(guān)的蛋白酶家族，其抑制作用與其濃度密切相關(guān)。目前認為Caspase－3是Caspase家族中引發(fā)細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)中的“核心”。該蛋白可切割染色體DNA，直接導(dǎo)致細胞凋亡，也可以裂解特異性的天冬氨酸底物，誘導(dǎo)細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)［6］。同時，某些基因如抑制凋亡蛋白（IAPs）家族則能夠通過影響Caspase－3的激活，對細胞凋亡起調(diào)控作用。

Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的IAPs家族成員之一，被認為是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的細胞凋亡抑制因子，其具有抑制細胞凋亡、促進細胞增殖和調(diào)節(jié)細胞有絲分裂的重要作用［7］。它在胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)，在終末分化的成人組織和癌旁正常組織中無表達（胸腺除外），而在轉(zhuǎn)化細胞株和人體內(nèi)幾乎所有的惡性腫瘤中均有明顯表達，且其表達還與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展、組織分化程度以及預(yù)后均密切相關(guān)，是許多腫瘤預(yù)后影響因子之一［8］。SHIN 等［9］的研究結(jié)果表明，Survivin主要通過抑制Caspase級聯(lián)反應(yīng)下游共同通路中的Caspase－3和Caspase－7發(fā)揮其抗細胞凋亡作用。

本實驗結(jié)果顯示，隨康萊特濃度的增加，Survivin蛋白表達顯著抑制，Caspase－3蛋白的表達顯著增高，Hep G2細胞凋亡也明顯升高。其原因可能是：康萊特一方面直接激活Caspase－3基因，促進Caspase－3蛋白的表達，引起細胞凋亡；另一方面通過抑制Survivin蛋白的表達，從而降低Survivin對Caspase－3的負調(diào)節(jié)作用，間接促進Hep G2細胞凋亡?，F(xiàn)階段研究表明，Survivin可能通過以下機制影響Caspase－3的表達：Survivin直接抑制Caspase－3、Caspase－7，從而阻斷細胞凋亡過程；Survivin結(jié)合周期蛋白激酶CDK4，間接抑制Caspase－3活性，阻礙線粒體釋放細胞色素C，進而阻斷細胞凋亡；Survivin通過Thr［34］位點磷酸化來調(diào)節(jié)Caspase的促細胞凋亡作用［10］；Survivin與第二個線粒體源的Caspase激活物（SMAC）結(jié)合保護IAPs對Caspase的抑制作用［11］。

現(xiàn)已知Survivin的表達呈細胞周期依賴性，即于S期表達增強，G2／M期達到最高水平，而G0／G1期表達下調(diào)，且在G2／M期時，高表達的Survivin與Caspase－3、Caspase－7一起定位于中心體微管上，可以防止Caspase－3、Caspase－7被激活而引起細胞凋亡。因此，干擾Survivin和微管蛋白的反應(yīng)，可致Survivin抗凋亡活性喪失，細胞 G2／M 期凋亡［12］。本實驗提示，康萊特干預(yù)后，可能通過影響Survivin周期依賴性表達的差異，阻滯肝癌細胞的G2＋M期，間接引起Hep G2細胞凋亡。

總而言之，本實驗結(jié)果顯示，康萊特作用后，隨著Survivin表達減弱，Caspase－3表達增強，細胞增殖抑制，細胞凋亡率增高。提示康萊特可能通過干預(yù)Survivin的表達，減弱其對Caspase－3的負調(diào)控作用，或直接激活Caspase－3來影響肝癌細胞的增殖與凋亡，但具體的作用機制尚需進一步探索。

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