吳瓊，謝慧，王風(fēng)芹，任天寶，宋安東

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州，450002)

琥珀酸，學(xué)名丁二酸，是一種常見(jiàn)的天然有機(jī)酸，除了存在于琥珀中外，還存在于人體、動(dòng)物、植物和微生物中。琥珀酸是TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物之一，在生物代謝中占有非常重要的位置。作為一種重要的碳四平臺(tái)化合物，琥珀酸是多種重要的中間產(chǎn)物和專業(yè)的化學(xué)制品，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、香料、油漆、塑料等行業(yè)。在2004年美國(guó)能源部公布的12種最有潛力的大宗產(chǎn)品中，琥珀酸排第一位［1］。琥珀酸也是公認(rèn)為繼檸檬酸和乳酸后的下一個(gè)大規(guī)模生產(chǎn)的有機(jī)酸產(chǎn)品［2］。估計(jì)全球琥珀酸的總產(chǎn)銷量為1～2萬(wàn)t，而全世界琥珀酸及其衍生物的市場(chǎng)潛在容量每年在27萬(wàn)t左右。

傳統(tǒng)的琥珀酸生產(chǎn)方法是依賴以石油為主的化石能源為原料來(lái)化學(xué)合成琥珀酸。目前，國(guó)際市場(chǎng)上琥珀酸的年需求量已超過(guò)15 000 t，年增長(zhǎng)速率平均為6%～10%，售價(jià)為14 000～16 000元/t，它們大部分是通過(guò)石化法生產(chǎn)得到的。然而，隨著全球能源危機(jī)的不斷加劇，導(dǎo)致石化法生產(chǎn)琥珀酸的成本逐年攀高，從而抑制了琥珀酸的發(fā)展?jié)摿?。新興的發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸以其低的能耗、高環(huán)保性和原料的可持續(xù)利用性而受到越來(lái)越多科學(xué)家們的重視。日本三井物產(chǎn)株式會(huì)社首創(chuàng)以玉米淀粉為起始原料發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的工藝，其年產(chǎn)在5 000 t左右。美國(guó)應(yīng)用碳化學(xué)公司早在2002年就采用微生物發(fā)酵法來(lái)生產(chǎn)琥珀酸，目前年產(chǎn)量為5 000 t。歐洲最大的淀粉及其衍生物生產(chǎn)商Roquette公司也在2009年將琥珀酸推向了商業(yè)化。

木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生資源，據(jù)估計(jì)木質(zhì)纖維質(zhì)原料占世界生物質(zhì)量(100億～500億t)的50%。我國(guó)是一個(gè)有著豐富植物纖維資源(如農(nóng)作物秸稈、林產(chǎn)品加工業(yè)下腳料等)的國(guó)家，每年僅玉米秸稈一項(xiàng)就超過(guò)1.7億t［3］。中國(guó)每年浪費(fèi)或低利用的纖維材料總共約10億t，其中農(nóng)作物秸稈一項(xiàng)約7億t，其主要成分為纖維素和半纖維素，它們都可通過(guò)水解的方法降解成相應(yīng)的低分子糖，進(jìn)而利用微生物發(fā)酵來(lái)大規(guī)模的轉(zhuǎn)化制備琥珀酸等生物基化工產(chǎn)品，產(chǎn)業(yè)前景相當(dāng)廣闊［4］。若能以農(nóng)作物秸稈水解液為主要原料產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)琥珀酸，將會(huì)有效減少現(xiàn)今琥珀酸發(fā)酵對(duì)淀粉原料的依賴性，并且降低了原料成本［5］。這不僅擺脫了對(duì)化石能源的依賴，而且開(kāi)辟了溫室氣體CO2利用的新途徑，使琥珀酸成為未來(lái)最重要的生物基化工產(chǎn)品之一［6］。

1 纖維水解液發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸工藝流程和目前水平

發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸的研究始于20世紀(jì)80年代，美國(guó)能源部在20世紀(jì)90年代初聯(lián)合Argonne National Laboratory等4個(gè)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)室以及應(yīng)用碳化學(xué)公司，投資700萬(wàn)美元來(lái)進(jìn)行琥珀酸的發(fā)酵與提取計(jì)劃的研究(W－31－109－Eng－38)［7］。國(guó)內(nèi)在這方面的研究還處于起步階段。蘇溧［8］等以葡萄糖為原料，在血清瓶中發(fā)酵24 h琥珀酸產(chǎn)量達(dá)8.3 g/L，在5 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)、葡萄糖質(zhì)量濃度分別為10 g/L和100 g/L時(shí)，琥珀酸的產(chǎn)量分別達(dá)到8.2 g/L和45.6 g/L。目前國(guó)內(nèi)外所報(bào)道的利用發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸的最高產(chǎn)量為 110 g/L［9］。

纖維水解液發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的過(guò)程首先是將纖維質(zhì)原料(如玉米秸稈、玉米籽皮、玉米芯等)利用物理或化學(xué)的預(yù)處理方法破壞纖維質(zhì)原料的內(nèi)部結(jié)構(gòu);再加入水解酶或能產(chǎn)生水解酶的微生物使纖維質(zhì)原料充分轉(zhuǎn)化為低分子糖類如葡萄糖和木糖等，最后通過(guò)微生物的發(fā)酵過(guò)程來(lái)生產(chǎn)琥珀酸。其工藝流程如圖1。Kim［10］等利用木材水解液作為產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌(Mannheimia succiniciproducens)的碳源，發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸，產(chǎn)量為11.73 g/L。Lee［11］等利用木質(zhì)水解液生產(chǎn)琥珀酸的最終產(chǎn)量達(dá)24 g/L。姚嘉旻［12］等通過(guò)稀酸水解玉米芯制備琥珀酸，產(chǎn)量最高可達(dá)35.2 g/L。目前，對(duì)纖維水解液發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的研究主要集中在工程菌株的定向選育、發(fā)酵微生物的代謝工藝優(yōu)化和纖維水解液脫毒工藝方面。李興江［13］等通過(guò)軟X射線誘變和代謝調(diào)控發(fā)酵菌株，最終利用秸稈水解液為原料使五、六碳糖共代謝產(chǎn)琥珀酸量達(dá)68.7 g/L。吳昊［14］等通過(guò)對(duì)玉米籽皮稀酸水解液脫毒處理后所產(chǎn)琥珀酸量達(dá)到43.2 g/L。

圖1 纖維水解液生產(chǎn)琥珀酸工藝流程圖

2 纖維水解液發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸相關(guān)微生物

菌種在發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸的過(guò)程中占有重要的地位。琥珀酸是一些厭氧和兼性厭氧微生物代謝途徑中的共同中間物［7］。大多數(shù)琥珀酸產(chǎn)生菌都是從反芻動(dòng)物的瘤胃中分離得到，如丙酸鹽生產(chǎn)菌、典型的胃腸細(xì)菌及瘤胃細(xì)菌都能夠分泌琥珀酸。目前的研究集中在產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)、大腸桿菌(E.coli)和產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniproducens)這3類菌上，前二者為兼性厭氧菌，發(fā)酵過(guò)程需要經(jīng)過(guò)好氧和厭氧兩個(gè)階段，在好氧階段需消耗底物以獲得較高的細(xì)胞密度，在厭氧階段才能達(dá)到高產(chǎn)琥珀酸;后者為專性厭氧菌，且不耐高濃度的底物，故限制了其工業(yè)生產(chǎn)前景，在最優(yōu)條件下(pH 6.2，高濃度CO2)，以葡萄糖為原料，其琥珀酸產(chǎn)量可達(dá)到35 g/L。近幾年也有通過(guò)構(gòu)建工程菌株使大腸桿菌在完全好氧的條件下來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的報(bào)道。表1列出了一些在發(fā)酵應(yīng)用中報(bào)道較多且產(chǎn)量較高的琥珀酸產(chǎn)生菌發(fā)酵方式和琥珀酸產(chǎn)量狀況的比較。

利用纖維水解液為原料產(chǎn)琥珀酸的微生物目前以產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)為主。產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)是從動(dòng)物的瘤胃中分離得到的一種革蘭氏陰性菌，經(jīng)16s rRNA鑒定為巴斯德菌科放線桿菌屬。葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、木糖等都是這類微生物可以利用的碳源，并能夠耐受高濃度的琥珀酸鹽。以葡萄糖為底物時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中主要有琥珀酸、乙酸以及少量的甲酸和乙醇。CO2的固定和利用對(duì)該菌種的琥珀酸產(chǎn)量有較大的影響，同時(shí)該菌種還能夠利用外源氫氣作為電子供體，并以富馬酸作為電子受體，以葡萄糖做底物在一般條件下琥珀酸的最終發(fā)酵產(chǎn)量可達(dá)50 g/L，而當(dāng)使用100%氫氣時(shí)，琥珀酸產(chǎn)量最高可達(dá)110 g/L［9］。李興江［15］等通過(guò)對(duì)琥珀酸放線桿菌產(chǎn)琥珀酸代謝工藝的優(yōu)化，得到以農(nóng)作物秸稈為原料發(fā)酵琥珀酸產(chǎn)量最高達(dá)73 g/L。雖然目前對(duì)該菌種的研究還較少，但該菌已是迄今為止報(bào)道耐高糖和高鹽的菌種，并已初步具備工業(yè)化生產(chǎn)的能力［16］。此外，產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniproducens)有報(bào)道稱也可以利用纖維水解液，琥珀酸產(chǎn)量可達(dá) 24 g/L［17］。Lee［18－20］等連續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌(Mannheimia succiniciproducens)利用木質(zhì)纖維素水解液為碳源連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸得率為55%，生產(chǎn)能力3.19 g/(L·h)，在連續(xù)發(fā)酵條件下的生產(chǎn)能力也是目前報(bào)道的最高值，顯示了良好的應(yīng)用前景。由于傳統(tǒng)菌株產(chǎn)琥珀酸能力還不強(qiáng)，近年來(lái)也有學(xué)者研究利用基因工程手段獲取高產(chǎn)琥珀酸的重組大腸桿菌。邢建民［21］等利用重組大腸桿菌ptsG突變株以玉米秸稈水解液為原料生產(chǎn)琥珀酸，產(chǎn)量達(dá)57.81 g/L。

表1 幾種主要的琥珀酸高產(chǎn)菌株發(fā)酵方式和產(chǎn)量狀況的比較

3 琥珀酸發(fā)酵生產(chǎn)代謝途徑和菌種選育

菌種的代謝途徑對(duì)琥珀酸的產(chǎn)量有著至關(guān)重要的影響。發(fā)酵法制備琥珀酸的過(guò)程是將EMP途徑中得到的PEP經(jīng)由TCA循環(huán)的還原支路，通過(guò)一步CO2固定和兩步還原反應(yīng)生成琥珀酸，該過(guò)程涉及的關(guān)鍵酶有磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、富馬酸酶和富馬酸還原酶［25］。圖2是產(chǎn)琥珀酸放線桿菌和產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌的代謝途徑。在厭氧條件下微生物通過(guò)PEP羧化激酶和PEP羧化酶途徑固定CO2產(chǎn)生琥珀酸;在好氧條件下也可通過(guò)異檸檬酸酶產(chǎn)生少量的琥珀酸［2］。磷酸烯醇式丙酮酸、草酰乙酸、蘋(píng)果酸、富馬酸是產(chǎn)琥珀酸放線桿菌產(chǎn)琥珀酸代謝途徑中的4種關(guān)鍵代謝副產(chǎn)物。而大腸桿菌產(chǎn)琥珀酸的代謝途徑較為復(fù)雜，且只能通過(guò)TCA循環(huán)中的還原支路生成琥珀酸，故琥珀酸的產(chǎn)量較低。圖3是大腸桿菌的琥珀酸代謝途徑。構(gòu)建產(chǎn)琥珀酸的重組大腸桿菌已成為目前琥珀酸發(fā)酵生產(chǎn)中的研究熱點(diǎn)。Vemuri［24］等將編碼丙酮酸羧化酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到大腸桿菌AFP111(AFP111/pTrc99A-pyc)中，通過(guò)好氧與厭氧兩步發(fā)酵76 h，以葡萄糖為底物發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸量可達(dá)99.2 g/L，見(jiàn)表1。這也是產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌研究中一個(gè)突破性的進(jìn)展，在目前眾多工程菌株中，該菌株也是發(fā)酵法制備琥珀酸最具工業(yè)價(jià)值的。Lee［26］等通過(guò)基因敲除獲得了不形成副產(chǎn)物的代謝工程菌，以葡萄糖為底物發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸水平達(dá)到52.4 g/L，比野生菌有了大幅度的提高。于麗［27］等還研究了重組大腸桿菌 JM001(△ppc)/pTrc99a-pck以葡萄糖為底物發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的性能，結(jié)果表明厭氧條件下產(chǎn)酸能力為對(duì)照菌株JM001的15.3倍。此外，Guettler等人［9］以產(chǎn)琥珀酸放線桿菌130Z(Actinobacillus succinogenes)為出發(fā)菌株，篩選出抗單氟乙酸的自發(fā)突變株FZ53。以葡萄糖為底物，發(fā)酵84h后可產(chǎn)琥珀酸量達(dá)66.4 g/L，而在最適條件下，此菌株的琥珀酸產(chǎn)量可以達(dá)到80～110 g/L，發(fā)酵時(shí)間48h，得率高達(dá)97%，而且乙酸等副產(chǎn)物極少，并能耐一定濃度的鹽溶液，具備了初步工業(yè)化生產(chǎn)的能力。McKinlay［28］等還通過(guò) NMR和 GC-MC分析13C原子標(biāo)記的代謝中間產(chǎn)物，對(duì)產(chǎn)琥珀酸放線桿菌130Z的代謝途徑和代謝流進(jìn)行了修正，最終證明了在高CO2和H2濃度下產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的琥珀酸產(chǎn)量的增加和甲酸、乙酸和乙醇副產(chǎn)物的減少。國(guó)內(nèi)研究中，李興江［13］等通過(guò)軟X射線誘變選育乙酸及乳酸代謝阻斷突變株，降低了乳酸和乙酸的代謝流量。同時(shí)，通過(guò)添加少量的檸檬酸鹽可間接促使琥珀酸代謝流量的增加，最終使得以纖維水解液為原料發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸量達(dá)到68.7 g/L。黃秀梅［25］等通過(guò)外源添加一些代謝中間體提高了產(chǎn)琥珀酸放線桿菌HMP和EMP代謝途徑的通量比，解決了琥珀酸合成過(guò)程中還原力不足的矛盾。此外，一些金屬離子和維生素也會(huì)對(duì)琥珀酸放線桿菌產(chǎn)琥珀酸的代謝途徑產(chǎn)生影響。李興江［15］等通過(guò)研究一些金屬離子和維生素的添加濃度，最終得到利用纖維水解液為原料發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸量為58 g/L。

圖2 產(chǎn)琥珀酸放線桿菌和產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌的代謝途徑

圖3 大腸桿菌的琥珀酸代謝途徑

4 纖維水解液生產(chǎn)琥珀酸發(fā)酵條件優(yōu)化

4.1 CO2對(duì)琥珀酸發(fā)酵的影響

琥珀酸發(fā)酵過(guò)程是典型的厭氧發(fā)酵。無(wú)論是以葡萄糖為原料還是以纖維水解液為原料發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸，CO2和H2對(duì)琥珀酸的代謝有著重要的作用，直接影響琥珀酸的產(chǎn)生［29］。增大CO2濃度和(或)H2的濃度，可提高琥珀酸的產(chǎn)量。研究表明，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌130Z的培養(yǎng)基中CO2水平低時(shí)，琥珀酸產(chǎn)量會(huì)減少。因此，當(dāng)前研究者大多采用在發(fā)酵罐中持續(xù)不斷地通入CO2的發(fā)酵工藝，以保證琥珀酸產(chǎn)生菌對(duì)CO2的固定，這也是琥珀酸發(fā)酵工藝中與其他有機(jī)酸發(fā)酵所不同的地方［30］。發(fā)酵過(guò)程中外源供給CO2的形式可以是碳酸鹽也可以是CO2氣體。在培養(yǎng)基中添加碳酸鹽可以與發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸反應(yīng)，釋放出CO2用于合成琥珀酸，同時(shí)還可調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值;以CO2氣體作為CO2供體時(shí)，則還需流加堿液以中和發(fā)酵過(guò)程所產(chǎn)生的琥珀酸等有機(jī)酸。陳可泉［31］等在對(duì) Actinobacillus succinogenes NJ113 的研究表明，以CO2氣體作為CO2供體，底物為葡萄糖時(shí)菌體生長(zhǎng)、CO2固定效率、琥珀酸產(chǎn)率以及琥珀酸得率均優(yōu)于碳酸鹽。李興江［32］等通過(guò)單因素試驗(yàn)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析得出以秸稈水解液為原料發(fā)酵琥珀酸的最佳條件為:CO2體積含量62%、H2體積含量5.4%及生物素微量濃度為7.8 mmol/L時(shí)，產(chǎn)酸最高為75.8 g/L。PEP羧化激酶是產(chǎn)琥珀酸放線桿菌厭氧合成琥珀酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶［33］。它參與了對(duì)CO2的固定并直接影響著后續(xù)代謝環(huán)節(jié)的進(jìn)行和琥珀酸的產(chǎn)量。理論上每生成1 mol琥珀酸需要消耗1 mol CO2。如果將發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸與其它能產(chǎn)生CO2的生產(chǎn)過(guò)程(如發(fā)酵生產(chǎn)乙醇)進(jìn)行耦合，不僅可將釋放的CO2加以利用，實(shí)現(xiàn)多種產(chǎn)物聯(lián)產(chǎn)，而且還可減少溫室氣體的排放。在微生物固定CO2產(chǎn)生琥珀酸的反應(yīng)過(guò)程中，培養(yǎng)基中的碳酸鹽含量、發(fā)酵液的pH值、溫度、攪拌轉(zhuǎn)速及等均可影響到CO2的固定過(guò)程［31，34］。因此，通過(guò)優(yōu)化和控制發(fā)酵培養(yǎng)的條件，可以增強(qiáng)CO2的固定效果，從而提高琥珀酸的產(chǎn)量。Guttler［35］等通過(guò)考察得出了Actinobacillus succinogenes 130Z的最適生長(zhǎng)和產(chǎn)酸pH值為6.8。同時(shí)，固體碳酸鹽也是調(diào)節(jié)pH值的理想物質(zhì)。陳可泉［31］等在5 L發(fā)酵罐中對(duì)Actinobacillus succinogenes NJ113進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化，得到結(jié)果表明，以CO2氣體作為CO2供體，葡萄糖為原料，通氣量為0.75 L/min，攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min，培養(yǎng)溫度為37℃，pH值是6.6時(shí)為最佳條件，其最終CO2固定速率達(dá)到0.6 g/(L·h)，琥珀酸產(chǎn)率達(dá)到 1.61 g/(L·h)。Mark［34］等還研究了重組大腸桿菌AFP111以葡萄糖為底物時(shí)固定CO2的最適pH值為6.4，此外，作者還研究得出NO2、O2、CO和SO2這些氣體的少量存在并不會(huì)引起琥珀酸產(chǎn)量的減少。利用基因工程手段也可對(duì)CO2的固定過(guò)程進(jìn)行改造，通過(guò)增強(qiáng)琥珀酸代謝途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)和敲除或失活琥珀酸競(jìng)爭(zhēng)途徑中的酶基因來(lái)提高琥珀酸的產(chǎn)量。Kim［36］等利用基因重組技術(shù)，將琥珀酸放線桿菌中丙酮酸羧化酶基因pck在已敲除ppc基因的突變菌株大腸桿菌K.12 ppc中過(guò)量表達(dá)，結(jié)果表明過(guò)量表達(dá)丙酮酸羧化酶最終使琥珀酸的產(chǎn)量提高了6.5倍［37］。

4.2 培養(yǎng)基對(duì)琥珀酸發(fā)酵的影響

不同碳源的培養(yǎng)基對(duì)提高琥珀酸產(chǎn)量影響不大，主要是控制接種量和加入適量的 Na+和 Mg2+［38］。目前，培養(yǎng)基優(yōu)化方面的研究主要以葡萄糖為底物進(jìn)行優(yōu)化。而以纖維水解液為原料進(jìn)行的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究還非常欠缺。鄭璞［39］等對(duì)琥珀酸放線桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化后，得到以葡萄糖為原料產(chǎn)琥珀酸的量為41.69 g/L。此外，加入一定量的碳酸鈉可提高大腸桿菌AFP18的產(chǎn)酸率［40］。

4.3 發(fā)酵方式對(duì)琥珀酸發(fā)酵的影響

發(fā)酵方式對(duì)于在工業(yè)化生產(chǎn)中提高琥珀酸的產(chǎn)量有著重要的影響。目前以纖維水解液為原料發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的發(fā)酵方式多為分批式發(fā)酵，而補(bǔ)料發(fā)酵還研究較少。鄭璞［41］等以秸稈水解液作為原料，對(duì)比了分批與補(bǔ)料兩種方式發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸，其產(chǎn)量分別為45.5 g/L和53.2 g/L。董晉軍［42］等還利用菊芋原料以同步糖化補(bǔ)料分批發(fā)酵的方式生產(chǎn)琥珀酸，最終產(chǎn)量達(dá)98.2 g/L，發(fā)酵效果明顯優(yōu)于糖化后發(fā)酵。

5 纖維水解液發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸脫毒工藝

纖維水解液作為琥珀酸產(chǎn)生菌的發(fā)酵原料，是經(jīng)過(guò)物理或化學(xué)的預(yù)處理方法處理后所得到的。這個(gè)過(guò)程會(huì)發(fā)生一系列反應(yīng)，產(chǎn)生大量的色素和有機(jī)酸、糠醛、多酚類等化合物，水解液呈黑褐色，這些物質(zhì)都屬于發(fā)酵抑制物，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)與代謝，必須加以脫除。目前，報(bào)道最多且最常用的方法是活性炭脫毒。姜岷［43］等研究了稀酸水解玉米皮制備琥珀酸發(fā)酵糖液的工藝條件，其水解液經(jīng)活性炭脫色后，在厭氧條件下發(fā)酵表明玉米皮水解液可替代葡萄糖作為琥珀酸發(fā)酵的碳源。吳昊［14］等利用活性炭脫毒后的玉米籽皮水解液發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸，得到的琥珀酸產(chǎn)量達(dá)42.3 g/L。同時(shí)，水解液的脫色率為92.27%，糠醛脫除率75%，5-羥甲基糠醛脫除率53%，多酚類化合物脫除率98%，總糖損失低于5%。此外，黃秀梅［5］等利用活性炭和Ca(OH)2同時(shí)使用去除玉米秸稈水解液中的發(fā)酵抑制物，使琥珀酸的產(chǎn)量達(dá)到66.23 g/L，抑制物糠醛及羥甲基糠醛(HMF)的去除率分別為91.11%、89.83%，而總糖損失率僅為5.57%。

6 面臨問(wèn)題及展望

琥珀酸作為一種優(yōu)秀的化學(xué)平臺(tái)產(chǎn)品，用途廣泛。通過(guò)生物轉(zhuǎn)化法，經(jīng)過(guò)合理的過(guò)程優(yōu)化，具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。利用纖維水解液發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸不僅綠色環(huán)保，而且可以緩解當(dāng)前所面臨的糧食危機(jī)和溫室氣體CO2引起的溫室效應(yīng)。目前，發(fā)酵法大量生產(chǎn)琥珀酸還面臨著很多潛在的問(wèn)題，具體主要有以下幾個(gè)方面:

(1)以纖維水解液為原料的發(fā)酵條件優(yōu)化方面還有待研究，尤其是發(fā)酵培養(yǎng)基條件的優(yōu)化。目前，以纖維水解液為原料發(fā)酵琥珀酸的研究主要集中在菌種代謝調(diào)控方面，發(fā)酵條件的優(yōu)化方面還研究很少。由于纖維水解液中成分復(fù)雜且含有多種有毒物質(zhì)，抑制琥珀酸產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)和代謝。因此，獲得一種以纖維水解液為原料的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基條件對(duì)琥珀酸的產(chǎn)量有著重要的影響。

(2)發(fā)酵過(guò)程難以達(dá)到厭氧環(huán)境，甚至發(fā)酵用水也須經(jīng)過(guò)脫氣處理，這在工業(yè)化生產(chǎn)中較難實(shí)現(xiàn)。若解決了控制厭氧條件難的問(wèn)題，將會(huì)大幅降低發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的成本。

(3)琥珀酸高產(chǎn)菌株的選育還不足。篩選或構(gòu)建一株能用于工業(yè)化生產(chǎn)的高產(chǎn)菌株是今后研究的熱點(diǎn)。目前對(duì)大腸桿菌的基礎(chǔ)研究較透徹，其生長(zhǎng)代謝速度快，是最有潛力的改造菌株，但產(chǎn)酸能力差，發(fā)酵困難，基因工程構(gòu)建菌株耗資多，菌株易退化，工業(yè)生產(chǎn)還有一定難度［1］。發(fā)酵同時(shí)產(chǎn)生大量雜酸也是亟待解決的問(wèn)題。利用基因工程技術(shù)改造大腸桿菌基因來(lái)達(dá)到高產(chǎn)琥珀酸將在未來(lái)受到重視。

隨著能源危機(jī)和糧食安全問(wèn)題的日益嚴(yán)重，利用纖維質(zhì)原料來(lái)生產(chǎn)琥珀酸在經(jīng)濟(jì)性、環(huán)境性、社會(huì)性等方面都具有巨大的優(yōu)勢(shì)。盡管目前全世界琥珀酸的市場(chǎng)需求量還不是很高，但一直處于快速增長(zhǎng)狀態(tài)。據(jù)2006年韓國(guó)Song［44］等報(bào)道丁二酸酯及聚酯的潛在市場(chǎng)將達(dá)到每年2 700萬(wàn)t。很多國(guó)家和科研院所都對(duì)纖維水解液生產(chǎn)琥珀酸的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)行了評(píng)估和探索，相信利用纖維水解液發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的產(chǎn)業(yè)化會(huì)在未來(lái)取得顯著的發(fā)展。

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